材料和试剂

50ml聚丙烯管（Corning），，Centristar ^TM，墨西哥）
1.5ml Eppendorf管（Hycon plastics，目录号：HCE-1004-MIC）
200μl带聚合物脚的锥形插入物（硼硅酸盐玻璃）（JG Finneran，美国）
带螺帽的琥珀色开口小瓶（Borosilicate glass）（JG Finneran，美国）
0.2微米Millipore过滤器（尼龙或纤维素过滤膜）（Sartorius Stedim biotech，德国）
集胞藻细胞（新鲜或冷冻于-20℃）
BG11生长培养基
去离子水
甲醇，AR级（RCI Labscan，泰国）
乙醇，AR级（QRec，新西兰）
氯仿（RCI Labscan，泰国）
盐酸（HCl）（QRec，新西兰）
NaH 2 PO 4（Carlo Erba试剂，Chausséedu Vexin，Val de Reuil，法国）
NaOH（Merck，Germany）
UP水，HPLC级（TEDIA，OH，USA）
乙腈CAN，HPLC级（Burdick和Jackson，Korea）
甲醇（MeOH），HPLC级（Burdick和Jackson，Korea）
谷氨酸和GABA的标准， 99％纯度（Sigma-Aldrich）
0.4M硼酸盐缓冲液，pH10.2（Agilent Technologies，目录号：5061-3339）
O-苯二甲醛试剂（OPA）（Agilent Technologies，目录号：5061-3335）
BG11生长培养基（参见配方）
HPLC溶剂A（参见配方）
HPLC溶剂B（参见配方）
OPA试剂（参见配方）

设备

250ml锥形瓶（Corning，Pyrex ，目录号：4980）。
Shaker（Eppendorf，型号：Innova ^TM 2100）
台式离心机（Hettich Lab Technology，型号：MIKRO220/220R）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：SI-0236）
超声实验室匀浆器（Sonuplus UW2200）
Centrivap浓缩器（Labconco，美国）
Shimadzu prominence超高速液相色谱系统（Shimadzu Scientific Instruments）
岛津突出物自动进样器（Shimadzu Scientific Instruments，型号：SIL-21A HT）
脱气器（Shimadzu Scientific Instruments，型号：DGU-20A5）
UV-vis检测器（Shimadzu Scientific Instruments，型号：SPD-20A）
反相柱（ZORBAX Eclipse AAA分析柱，4.6×150mm，5.0μm）（Agilent Technologies，目录号：93400-902）
保护柱（ZORBAX Eclipse AAA分析保护柱，4.6×12.5mm，5.0μm）（Agilent Technologies，目录号：820950-931）

程序

GABA和谷氨酸提取
1. 在含有棉塞的250ml锥形瓶中的总体积为50ml的BG11培养基中，在30℃下培养集胞藻细胞。
2. 通过在2,500×g离心10分钟，室温下，在生长的指数期（3至8天）收获细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬在500μl去离子H 2 O中，并将细胞悬浮液转移到1.5ml Eppendorf管中。将细胞以10,000×g离心10分钟，并通过微量移液管除去所有的水（此时，细胞可以在-20℃下冷冻一个月）。
3. 通过剧烈混合将细胞重悬于1.5ml的80％（v/v）甲醇中。在室温下孵育混合物几个小时（或孵育过夜），并使用超声均化器均化2分钟。
4. 通过在10,000×g离心10分钟，4℃，沉淀细胞碎片。收集上清液并将其转移到新的1.5ml Eppendorf管中，得到"甲醇提取物"
5. 在真空蒸发器中在40℃下干燥甲醇提取物5小时，并将干燥的沉淀物保持在室温下（可以省略步骤A6和7，参见下面的注释1）。
6. 向从步骤A4获得的细胞碎片中加入2ml的80％（v/v）乙醇，以相同的方式进一步再提取，得到"乙醇提取物"（参见步骤A2和A3）。
7. 在步骤A5中将乙醇提取物加入到先前从甲醇提取物获得的干燥沉淀中，并在40℃下在真空蒸发器中干燥。
8. 将干燥后得到的沉淀用250μl去离子水和50μl氯仿溶解，然后在10,000×g下离心10分钟，4℃。收集上层水相（收集足够量的水相，小心不要收集氯仿相），转移到新的1.5 ml Eppendorf管中。
9. 向水相中加入稀HCl，使最终浓度为0.1N。通过0.2μm微孔过滤器过滤溶液，然后通过HPLC检测GABA /谷氨酸。过滤的样品可以储存在-20℃下直到进一步使用
GABA和谷氨酸的HPLC分析
1. 用0.2μmMillipore过滤器过滤去离子水（或使用UP水，HPLC级），溶剂A和溶剂B.
2. 使用OPA试剂的预柱样品衍生化如下所述进行。
3. 使用梯度程序（表1）（参见注释3），在反相柱上使用溶剂A和溶剂B在2分钟内以2ml/min的流速在40℃（柱温箱温度）下进行分离。对于OPA衍生的样品，UV检测波长为338nm
4. 通过将峰面积与标准物的峰面积进行比较来进行GABA和谷氨酸盐含量的定量（在0.5μl样品中对于4.5至450pmol的浓度范围获得线性）。使用这些HPLC条件的谷氨酸和GABA的保留时间分别为3.0-3.7min和10.0-10.5min（参见数据分析，图2）（参见注释4）。
  
  图1.使用Shimadzu显微自动进样器进行GABA和谷氨酸分析的（A）锥形插入物，（B）透明开口小瓶和（C）螺帽的照片
  
  表1.单次运行的HPLC梯度程序设置

数据分析

图2.从蓝细菌集胞藻中提取的分离的氨基酸的代表性色谱图。 A.标准谷氨酸和GABA的色谱图，浓度为2nmol/ml; B.从集胞藻中分离氨基酸的色谱图。 PCC 6803提取物。数据获自Shimadzu LC溶液软件，并通过三次独立实验确认。

笔记

可以省略乙醇提取步骤。然而，为了确保氨基酸的完全定量回收，推荐这一步骤。
OPA试剂在氧存在下缓慢降解。立即将新衍生的反应混合物注入HPLC中
如果柱需要进一步清洗，程序可以通过用100％溶剂B柱洗涤20-30分钟，然后用缓冲液（溶剂A）平衡20-30分钟继续。
为了确保HPLC条件和标准品和样品的保留时间的一致性，定期运行标准品很重要。

食谱

BG11生长培养基
注意：BG11生长培养基的制备在Rippka等，1979中有详细描述。
HPLC溶剂A
40mM NaH 2 PO 4，pH 7.8 在1L水中溶解5.5g NaH 2 PO 4 H 2·H 2 O·
用10N NaOH溶液调节pH
HPLC溶剂B
ACN：MeOH：水（45:45:10，v/v/v）洗脱
OPA试剂
10mg/ml邻苯二甲醛
10mg/ml 3-巯基丙酸 0.4M硼酸盐缓冲液，pH 10.2

致谢

GABA和谷氨酸盐提取的方法改编自Bieleski和Turner（1966），有一些修改。用于检测和定量GABA和谷氨酸的基于HPLC的方法是Henderson等人公布的方案的修改。（2006）。这项工作是由朱拉隆功大学（CU）Ratchadaphiseksomphot捐赠基金（食品和水集群，CU-58-011-FW）和泰国研究基金（IRG5780008）的研究拨款支持。 Simab Kanwal感谢CU研究生院提供博士后的奖学金。

参考文献

Bieleski，RL和Turner，NA（1966）。分离和通过薄层电泳和色谱法估计粗制植物提取物中的氨基酸。生化。 17：278-293。
Henderson，JW，Ricker，RD，Bidlingmeyer，BA和Woodward，C.（2006）。快速，准确，灵敏，可重复的氨基酸HPLC分析。 5980-1193EN：1-10。

Kanwal，S.和Incharoensakdi，A.（2016）。表征来自集胞藻的谷氨酸脱羧酶 PCC 6803及其在氮代谢中的作用。 Plant Physiol Biochem 99：59-65。

Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，JB，Herdman，M.and Stanier，RY（1979）。蓝藻菌的纯培养物的通用分配，菌株历史和性质。 J Gen Microbiol ：1-61。