材料和试剂

化学品
1. 常见化学品，缓冲液和试剂盒
  1. 蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000002）
  2. 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP310）
  3. 氢氧化钠（NaOH）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP359）
  4. 氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
  5. 乙二胺四乙酸（EDTA），二钠盐二水合物（Na 2 EDTA·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：E1644）
  6. DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
  7. 聚乙烯吡咯烷酮（平均分子量10,000）（Sigma-Aldrich，目录号：PVP10）
  8. 氯化钾（KCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP366）
  9. 焦磷酸四钠（PPi）十水合物（Na 4 P 2 O 7 O 10·10H 2 O）（Sigma-Aldrich ，目录号：S6422）
2. 底物和辅因子
3. 酶
  1. 来自酿酒酵母的己糖激酶（E.C.2.7.1.1）（Sigma-Aldrich，目录号：H5000）
  2. 来自酿酒酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH，E.C.1.1.1.49）（Sigma-Aldrich，目录号：G7877）
  3. 来自兔肌肉（Sigma-Aldrich，目录号：P3397）的磷酸葡萄糖变位酶（PGM，E.C.5.4.2.2）
  4. 来自兔肌肉的丙酮酸激酶（E.C.2.7.1.40）（Sigma-Aldrich，目录号：P1506）
4. 库存解决方案（参见配方）
  1. 20mM ADP-葡萄糖
  2. 10 mM NADP
  3. 20mM PEP
酶活性反应混合物
1. 提取缓冲液（参见配方，第1部分）
2. AGPase活性反应混合物（参见食谱，第3a部分）
3. 淀粉合酶活性反应混合物（参见食谱，第3b部分）
4. 用于淀粉合酶活性测定的溶液1（丙酮酸激酶反应混合物）（参见Recipes，section 3c）
5. 用于淀粉合酶活性测定的溶液2（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应混合物）（参见Recipes，第3d部分）
植物材料
1. 普通小麦（<普通小麦 L.）颗粒
其他材料
1. Eppendorf管（1.5和2.0ml）
2. Falcon管（15ml）
3. 液氮
4. 微量离心管锁盒（例如，Sigma-Aldrich，目录号：Z708372或Sorenson Bioscience MCT LidLock ^TM，目录号：11870）注意：产品Z708372已停产。
5. Miracloth（Merck Millipore，目录号：475855）

设备

瓷砂浆和杵
分析天平（容量 - 100g或更高，分辨率 - 0.001g或更好）
适用于30°C的数字加热块或水浴和适用于100°C的数字加热块或水浴
注意：对于某些分析步骤，需要立即从30°C转移至100°C。这就是为什么需要同时使用两个加热装置的协议。
带适当转子的冷冻超速离心机适用于以高达12,000×g 旋转15ml Falcon管和1.5-2ml Eppendorf管。
紫外（UV）/可见分光光度计配备有加热的细胞保持器，适于保持比色皿温度在30℃。我们使用GE Healthcare/Amersham Bioscience Ultrospec 3100 Pro UV/Visible分光光度计（Biochrom Ltd，Cambridge，UK）。

程序

酶提取程序的总结如流程图（图3）所示。

图3.从发育中的小麦种子中提取AGPase，SSS和GBSS的流程图请参阅协议正文，了解每个步骤所需的特定条件和缓冲液/培养基组成。

分析前的小麦籽粒收获和储存
在开花后不同时间点（图4），在液氮中从初级和次级分蘖收获小麦的发育谷物，并储存在-80℃直至进一步使用。必须注意不要解冻冷冻的谷物直到酶测定，因为解冻谷物将严重影响分析的结果。

图4.开发小麦cv的种子。开花后4,8,16和25天的Yecora Rojo
萃取
1. 在预冷却的研钵中使用液氮将小麦籽粒研磨成细粉末，并将研杵和研磨的组织转移到用液氮预冷却的空的预先称重的Falcon管中。测定磨碎的组织的重量。这通过首先称重空的Falcon管，然后称重，再次填充研磨的组织来进行。两个读数的差等于地面组织的净重。记录该值并用于进一步的计算（ m ，参见计算，等式1,2,4,5,7）。
2. 制备提取缓冲液并保存在冰上（见Recipes，第1部分）
3. 向每100mg的研磨组织中加入1ml冰冷的提取缓冲液，然后匀化
4. 将匀浆通过用提取缓冲液润湿的两层Miracloth过滤，并在4℃以12,000×g离心10分钟，将含有粗酶的上清液转移到新管中，并储存在冰上。
5. 将淀粉颗粒的颗粒上形成的黄色储存蛋白层刮掉并丢弃（图5）
  
  图5.植物组织匀浆的分级。离心后，沉淀由两层组成;上层由储存蛋白形成，下层由淀粉颗粒形成。将上清液收集到单独的管中并用于AGP酶和SSS测定。通过刮刀除去沉淀的上层（储存蛋白质）并丢弃。下层（淀粉颗粒）在洗涤后用于GBSS测定
6. 通过离心除去所有痕量的SSS，用2-4ml *的提取缓冲液洗涤淀粉颗粒的颗粒两次。将第一次洗涤后获得的上清液与起始的（步骤B4）组合，并将合并的上清液用于AGP酶和SSS活性测定。记录合并的上清液的体积用于进一步的计算（参见计算，方程式1,2,4和5）。弃去第二次洗涤后的上清液** 注意：用于洗涤的提取缓冲液的体积应足以洗涤淀粉颗粒沉淀，但不能过量以避免提取物的稀释。使用提取缓冲液体积等于步骤B3中使用的体积的20-25％是一种好习惯。
  注意：淀粉颗粒丸洗涤的目的是消除GBSS级分的SSS污染。第一次洗涤中SSS的量可以显着影响SSS活性测定的最终结果。这就是为什么第一次洗涤的上清液与主要提取物混合的原因。第二次洗涤可能含有一些SSS活性，但该量不会显着影响测定的最终结果，并且可以丢弃以避免主提取物的额外稀释。
7. 将淀粉颗粒的颗粒重悬于0.5-2.0ml *的提取缓冲液中，并保存在冰上直至用于GBSS活性测定。记录悬浮液的体积并用于进一步计算GBSS活性（参见计算，等式7）。
  注意：用于重新悬浮淀粉颗粒的缓冲液的体积取决于收集的颗粒的量。对于大量的颗粒，使用较大体积的重悬缓冲液，但不要超过步骤B6中使用的体积。
酶活性测定
1. AGPase活性测定
  AGPase活性测定程序的总结显示在流程图中（图6）。
  
  图6. AGPase测定的流程图。请参阅方案的正文，了解测定每个步骤所需的特定条件和缓冲液/培养基组成。
2. 可溶性淀粉合成酶（SSS）活性测定
  SSS和GBSS活性测定程序的总结如流程图（图7）所示。
  
  图7. SSS和GBSS测定的流程图。请参阅方案的正文，了解测定每个步骤所需的特定条件和缓冲液/培养基组成。
3. 颗粒结合淀粉合酶（GBSS）活性测定
4. 蛋白质含量的测定
计算
1. AGPase
  1. AGP酶的酶活性以酶单位表示。就该方案而言，将AGP酶的一个酶单位（μg）确定为在pH7.5下每1分钟将1微摩尔ADP-葡萄糖转化为葡萄糖-1-磷酸酯的酶活性量，在30℃
  2. AGP酶的酶活性对组织鲜重的影响可以根据公式（1）计算。
    
    在哪里，
    6.22      -        NAD（P）H在340nm处的微摩尔吸光系数， cm 2 ·μmol< em> -1 ，
    Abs ₃₄₀ -       Absorbance在340nm处测量的实验管对参比管的反应混合物的反应混合物，
    FW          -       AGPase的酶活性以鲜重计算，U·g ^-1 em>，
    L             - -      光程长度，/em>。在大多数情况下，此参数为1.0 cm，
    m         -     样品的鲜重， g ，
    t                 ，
    V ₁            -      提取量， ml ，
    V ₂           -      添加到反应混合物中的提取液体积， ml ，
    
    在哪里，
    AGP酶的酶活性以蛋白质计算，U·mg ^-1 ，
    C _pr -      提取物中的蛋白质浓度， mg·ml ^-1 ，
    和其他参数与等式（1）相同。
2. 淀粉合酶
  1. 淀粉合酶（SSS和GBSS）的酶活性以酶单位表示。就该方案而言，将淀粉合酶（SSS和GBSS）的一个酶单位（U e）确定为将1微摩尔ADP-葡萄糖转化为淀粉的酶活性量和1微摩尔 ADP每1分钟，pH7.5和30℃
  2. SSS的酶活性对组织鲜重的影响可以根据等式（4）计算。
    
    在哪里，
    ; SSS的酶活性基于鲜重计算，U·g ^-1 ，
    6.22       - 在340nm处的NAD（P）H的微摩尔吸光系数，cm 2 ·μmol^-1 ，
    Abs 340nm，相对于参比管的反应混合物，
                 在大多数情况下，此参数为1.0 cm，
    m             -       样品的鲜重，/em>，
    t            -      反应时间，最小，
    提取量， ml ，
    V 添加到反应混合物中的提取物体积， ml ，
    最终反应混合物的体积， ml ，
    SSS反应混合物的体积， ml ，
    在通过煮沸停止反应后取得的SSS反应混合物的等分试样的体积，em 。
  3. 可以根据等式（5）和（6）计算SSS对蛋白质的酶活性。
    
    在哪里，
    ;以蛋白质计算的SSS的酶活性，U·mg ^-1 ，
    C 提取物中的蛋白质浓度， mg·ml ^-1 ，
    和其他参数与等式（4）相同。
  4. GBSS的酶活性对组织鲜重的影响可以根据等式（7）计算：
    
    在哪里，
    _FW -      酶活性以鲜重计算，
    6.22        - 在340nm处的NAD（P）H的微摩尔吸光系数，cm 2 ·μmol^-1 ，
    Abs 在340nm下相对于参比管的反应混合物，
                      > cm 。在大多数情况下，此参数为1.0 cm，
    m            -       /em>，
    t > min ，
    V ₃           -      反应混合物的最终体积，
    V ₄          -        GBSS反应混合物的体积， ml ，
    V ₅        -      通过煮沸停止反应后取得的GBSS反应混合物的等分试样的体积， ml ，
    V ₆         -      淀粉颗粒悬浮液的体积， ml ，
    V ₇         -       将添加到反应混合物中的淀粉颗粒悬浮液等分试样的体积， ml
  5. 在该方案中，我们没有测量淀粉颗粒悬浮液中的蛋白质含量，这就是为什么本协议框架中的GBSS活性只能基于鲜重计算。

食谱

提取缓冲区
100mM HEPES-NaOH（pH7.5） 8mM MgCl 2/v/v 2mM EDTA 1 mM DTT
12.5％（v/v）甘油 5％（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP-10）
库存解决方案
1. ADP-葡萄糖，二钠盐（MW = 633.31），20mM
  在储备容器中制备ADP-葡萄糖储备溶液。将0.79ml无菌水直接加入含有10mg粉末的瓶中。将溶液少量分装，并储存在-20℃以避免重复解冻
2. NADP，钠盐水合物（MW = 765.39，无水基），10mM 将7.8mg NADP溶解于1ml无菌水中。将溶液少量等分并保存在-20℃以避免重复解冻。被冷冻后，NADP溶液稳定约一年。
3. PEP单钠盐水合物（MW = 190.02，无水基），20mM/dm 将3.9mg PEP溶解于1ml无菌水中。将溶液少量分装并储存在-80℃下以避免重复解冻。
酶活性反应混合物

AGP酶活性反应混合物（表1）注意：如果AGP酶活性低（Abs <340>低于0.05），则可以以相应降低dH 2 O O为代价增加酶提取物的体积已添加卷。

表1. AGPase活性反应混合物的组成
淀粉合酶活性反应混合物（表2）
注意：如果SSS/GBSS活性低（Abs 340低于0.05），则酶提取物/淀粉颗粒悬浮液的体积可以以dH的相应降低为代价而增加， 2 O体积。在SSS的情况下，可以使用更浓缩的DDT。例如，在250mM储备液的情况下，必须加入27μl而不是135μl的DTT储液，并且可以向反应混合物中加入308μl而不是200μl的酶提取物。

表2.淀粉合酶活性反应混合物的组成
用于淀粉合酶活性测定的溶液1（丙酮酸激酶反应混合物）（表3）
注意：在进行测定时，溶液1应每次都新鲜。

表3.溶液1（丙酮酸激酶反应混合物）的组成
用于淀粉合酶活性测定的溶液2（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应混合物）（表4）
注意：在进行测定时，溶液2应每次清新。

表4.溶液2（G6PDH反应混合物）的组成

致谢

这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究理事会给予BTA的资助。作者感谢Nina Kulichikhina女士提供的技术援助。该协议改编自Nakamura等人。（1989）和Schaffer和Petreikov（1997）。

参考文献

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Mukherjee，S.，Liu，A.，Deol，KK，Kulichikhin，K.，Stasolla，C.，Brule-Babel，A.and Ayele，BT（2015）。在谷物灌浆期间蔗糖转运和蔗糖到淀粉代谢相关基因的转录协调和脱落酸介导的调节（ Triticum aestivum L.）。 Plant Sci 240：143-160。
Nakamura，Y.，Yuki，K.，Park，SY和Ohya，T。（1989）。在稻谷发育的胚乳中的碳水化合物代谢。植物和细胞生理学 30（6）：833-839。
Schaffer，AA和Petreikov，M。（1997）。淀粉代谢在番茄果实中经历瞬时淀粉积累。植物生理学113（3）：739-746。
Vos-Scheperkeuter，GH，de Boer，W.，Visser，RG，Feenstra，WJand Witholt，B。（1986）。在马铃薯块茎中鉴定颗粒结合的淀粉合酶。植物生理学82（2）：411-416。