材料和试剂

人胚胎干细胞（hESC）将未分化的hESC在补充有20％KnockOut血清替代物，0.1mM非必需氨基酸（NEAA），1mM GlutaMAX TM TM-培养基的DMEM/F12培养基中在经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞 0.1mM 2-巯基乙醇（均来自Invitrogen）和8ng/ml重组人FGF2（Peprotech，目录号：100-18B）。
Matrigel（BD Biosciences，目录号：354230）
诺考达唑（Sigma-Aldrich，目录号：M1404）
胸苷（Sigma-Aldrich，目录号：T1895）
Aphidicholine（Sigma-Aldrich，目录号：A0781）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
二甲基亚砜（DMSO）
诺考达唑储备溶液（见配方）
胸苷储备液（见配方）
Aphidicholine储备溶液（见配方）

设备

离心机（Eppendorf 5415D离心机）
荧光激活细胞分选仪（FACS，FACScan机，Stanford FACS设备）

程序

在G2/M阶段同步hESCs
1. 方法I
  1. 第一天通过hESCs到matrigel。第二天，更换培养基。
  2. 第三天，将200ng/ml的诺考达唑加入到新鲜培养基中并在37℃下孵育16小时。
  3. 16小时后，收获细胞，并准备小等分用于通过FACS进行细胞周期分析
2. 方法二
  1. 第一天通过hESCs到matrigel。第二天，更换培养基。
  2. 第三天，向新鲜培养基中加入2mM胸腺嘧啶并在37℃下孵育10小时
  3. 取出含有胸腺嘧啶核苷的培养基，用PBS洗涤（在室温下储存）两次，以释放胸苷中的细胞。
  4. 加入新鲜培养基，并在37℃下再孵育10小时
  5. 加入nocodazole至终浓度为200ng/ml。在37℃下孵育24小时
  6. 收获细胞，并准备小等分用于通过FACS的细胞周期分析
在G1阶段同步hESCs
1. 方法I
  1. 第一天通过hESCs到matrigel。第二天，更换培养基。
  2. 第三天，向新鲜培养基中加入200ng/ml的诺考达唑并在37℃下孵育16小时。
  3. 取出含有诺考达唑的培养基，用PBS洗涤（在室温下保存）两次
  4. 加入补充有10μg/ml aphidicholine的新鲜培养基，并在37℃孵育9-10小时。
  5. 收获细胞，并准备小等分用于通过FACS的细胞周期分析
2. 方法二
  1. 第一天通过hESCs到matrigel。第二天，更换培养基。
  2. 第三天，向新鲜培养基中加入10μg/ml的aphidicholine，并在37℃下孵育20小时。
  3. 收获细胞，并准备小等分样品用于通过FACS的细胞周期分析
在S阶段同步hESCs
1. 方法I
  1. 在G2/M阶段同步hESCs，如A中所述。
  2. 取出含有诺考达唑的培养基，用PBS洗涤（在室温下保存）两次
  3. 添加新鲜培养基释放细胞，孵育hESCs在37℃。每小时收集细胞，并准备小等分用于通过FACS进行细胞周期分析。通常S期细胞群体在出现诺卡达唑阻滞后5-6小时出现
2. 方法二
  1. 按照B中所述同步hESC在G1阶段。
  2. 取出含有aphidicholine的培养基，用PBS洗涤（在室温下保存）两次
  3. 添加新鲜培养基释放细胞，孵育hESCs在37℃。每小时收集细胞，并准备小等分用于通过FACS进行细胞周期分析。通常S期细胞群出现在从aphidicholine阻滞释放后2-3小时

食谱

诺考达唑储备液
将诺考达唑溶于DMSO中
5mg/ml的储备浓度
胸苷储备液
将胸苷溶解在ddH 2 O中
库存浓度为100 mM
Aphidicholine储备液
将aphidicholine溶解在DMSO中
库存浓度为10mg/ml

致谢

这项工作由加利福尼亚再生医学研究所，批准RL1-00100支持。

参考

Becker，K.A.，Ghule，P.N.，Therrien，J.A.，Lian，J.B.，Stein，J.L.，van Wijnen，A.J.and Stein，G.S。（2006）。人类胚胎干细胞的自我更新受缩短的G1期细胞周期的支持。 J Cell Physiol 209（3）：883-893
Neganova，I.，Zhang，X.，Atkinson，S。和Lako，M。（2009）。 G1至S调节成分的表达和功能分析揭示了CDK2在细胞周期调节中的重要作用人胚胎干细胞。癌基因 28（1）：20-30