材料和试剂

圆锥管
宽口螺旋盖高密度聚乙烯（闪烁）小瓶
13×100mm试管
培养皿
来自Pall Gelman的过滤器型A/C 25mm玻璃纤维过滤器
12 x 75 mm玻璃试管
木制涂抹器（在本协议中用于将含有放射性细胞的过滤器放在试管内的薄木棒，将由G计数器读取）
一次性真空过滤系统（TPP，目录号：99950）
Paracoccidioides 单元格
文化媒体

具有4％葡萄糖的液体脑心浸液肉汤（BHI）（Sigma-Aldrich，目录号：53286）
液体合成完全（SC介质）（参见配方）

去离子水
没有氨基酸的酵母氮基（YNB）（BD，Difco ^TM，目录号：291940）
葡萄糖（VWR，目录号：101175P）
氨基酸（Sigma-Aldrich）
ADE，TRP，HIS，ARG，MET，TYR，ISOLEU，LYS，PHE，GLU。 ACID，ASP。 ACID，VAL，THR，SER，URA，LEU
台盼蓝溶液，0.4％用于显微镜（Sigma-Aldrich，目录号：93595）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
琥珀酸（Sigma-Aldrich，目录号：398055）
Tris
NaOH
分析葡萄糖
MES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
柠檬酸钠
< sup> 59（Perkin-Elmer，目录号：NEZ037001MC）
1M抗坏血酸（0.176g，在1ml无菌水中）
硝酸（HNO 3）
碾红菲咯啉二磺酸（BPS）（Sigma-Aldrich，目录号：B1375）
氯化铁（III）（Sigma-Aldrich，目录号：157740）
SC完整媒体（见配方）
氨基酸溶液（参见配方）
氨基酸混合物（见配方）
⁵⁹ Fe储备溶液（见配方）
10x淬火缓冲液（参见配方）
柠檬酸摄取缓冲液（参见配方）
酸洗玻璃器皿处理（见配方）

设备

振动器
血细胞计数器
微细钳子
玻璃器皿（erlenmeyers，带蓝色瓶盖的瓶子，烧杯，圆筒）
磁力搅拌器
pH计
涡流
G计数器（LKB Wallac Compu Gamma），带塑料计数管支架
真空过滤歧管（Merck Millipore，型号：1225）
真空源，标准实验室泵或吸水器
高压灭菌

程序

种植 Paracoccidioides spp。细胞（来自于在4％葡萄糖培养基中在4％葡萄糖培养基中在4％葡萄糖培养基中生长至少72小时的库存）在具有4％葡萄糖培养基的200ml BHI中在36℃振荡（约300rpm）72小时。之后，收集在具有台盼蓝溶液**的血细胞计数器中计数的5×10 6个活细胞**，并转移至30ml未补充或补充有200μMBPS或10μMFeCl 2的SC培养基> 3℃，在36℃下摇动24小时 *注意：这个股票一直存活直到七天。之后，必须在含有含4％葡萄糖培养基的新鲜BHI的管中开始新的培养。
注意：为了计数活细胞，将细胞在0.9％NaCl溶液中稀释100次（可以是两次1:10连续稀释）。稀释后，得到10微升的细胞，并与10微升的台盼蓝溶液混合。这对应于1:200的最终稀释。获得10微升的混合物，并使用血细胞计数细胞。活细胞不会吸收蓝色染料，并保持无色。
通过在4℃下以1,200×g离心10分钟将20ml细胞收集到锥形管中，并用在柠檬酸盐吸收缓冲液中的1mM EDTA洗涤细胞一次。
用柠檬酸盐摄取缓冲液（pH 6.0）洗涤细胞两次
用柠檬酸盐吸收缓冲液重悬细胞至最终体积为15ml
转移7毫升的细胞到闪烁瓶。如果你有两个以上的时间点，你需要超过7毫升的细胞
孵育细胞15分钟，在36℃下摇动，然后加入59 Fe。
在摇动细胞的同时，从每个闪烁瓶中取出等分试样（100μl），并通过血细胞计数器用台盼蓝溶液计数活细胞。
注意：这个步骤对于实验结束时的数据标准化很重要，因为数据将以pmol/sup/6活细胞/时间表示。。
对于还原酶非依赖性的59 Fe吸收，将在蒸馏H 2 O中的140μl1M抗坏血酸加入到每个闪烁管中（20mM终浓度）。
注意：抗坏血酸溶液应在使用前立即进行。
开始吸收，向每个闪烁瓶中加入70μl20μM的 Fe溶液。
在每个时间点（确保具有零时间点），停止振荡器，小心地移除闪烁瓶，并将1ml细胞吸入含有3ml冰冷的1×淬灭缓冲液的13×100mm试管中。对每个时间点重复三次（图1）。

图1.淬灭摄取样品。在每个时间点，从吸收管中取出1ml样品，并在3ml冰冷的淬灭缓冲液中淬灭。在收集1ml样品后立即添加淬灭缓冲液很重要。
对于细胞的过滤和洗涤，在培养皿中的1x淬灭缓冲液中预先浸泡过滤器
使用微型镊子，小心地在歧管上放置12个过滤器（只保持过滤器的外边缘）（图2）。将顶部放在歧管上，用蓝色塑料螺丝拧紧。使用冷水对过滤器歧管施加真空以形成真空。

图2.在Millipore歧管上放置过滤器。在启动真菌样品的Fe吸收之前，将过滤器在淬灭缓冲液中润湿，然后置于每个歧管的玻璃料帮助镊子。然后放置歧管上的顶部，并用蓝色塑料螺钉将其拧紧。使用冷水对过滤歧管施加真空以形成真空
收集所有样品后，在Millipore歧管上冲洗淬火的样品（图3）

图3.过滤淬灭的细胞样品。在收集和淬灭所有吸收样品后，将它们过滤并在歧管上洗涤三次。重要的是在＃1-12系列中清洗过滤器。不要洗涤过滤器＃1三次，然后继续洗涤＃2三次。如果收集多于歧管上的孔数，则去除前12个过滤器组以进行计数，并用新的过滤器替换，以继续洗涤额外的样品。
将样品倒在每个过滤器上。用3ml冰冷的1×淬灭缓冲液冲洗试管一次。将其倒在每个相应的过滤器上。用3ml冰冷的1×淬灭缓冲液冲洗每个过滤器三次。洗涤过滤器系列1-12。例如，不要在位置1清洗过滤器三次，然后继续在位置2清洗过滤器三次。在真空下离开歧管，直到您过滤并洗涤所有样品
将歧管留在真空下，让过滤器在最后一次清洗后干燥（〜30秒）。
使用镊子，通过将每个过滤器折叠在自身上（请勿触摸过滤器的中间或顶部），并将其放置在一个12 x 75毫米的玻璃试管中。
继续执行步骤11-15，直到所有样品都已处理完毕。
使用木制涂抹器，轻轻地将过滤器推到试管底部
将试管放在g计数器托架中，并计数样品，包括在12 x 75 mm试管中制备的^{59 Fe标准品。对于标准品，至少使用5个点，例如：20μM，10μM，1μM，0.1μM和0.05μM（图4）。}
按照制度环境健康和安全规定处置放射性废物

代表数据

图4. g计数器读数后期望获得的代表性数据标准品对于提供校准曲线很重要，从中可以将每分钟计数（Cpm）转换为pmol ⁵⁹ Fe（top graphic）。在用0时间点（第五列）归一化数据后，基于校准曲线计算pmol Fe，然后可以将⁵⁹ > Fe（以pmol）10 6个细胞可以一次内在化，在这种情况下为60分钟（下图）。

食谱

SC完成媒体
6.7g YNB至750去离子水
100ml 20％葡萄糖 100ml氨基酸溶液
无菌去离子水至1,000ml总体积
过滤灭菌介质
氨基酸溶液
2.26g氨基酸混合物料加到100ml去离子水中加热并搅拌溶液
允许冷却
氨基酸混合物
2克ADE
10 g TRP
10 g HIS
7.5克ARG
2.5 g MET
1.5克TYR
2.5 g ISOLEU
2.5克LYS
2.5 g PHE
5g GLU。 ACID
5g ASP。 ACID
7.5 g VAL
10 g THR
20克SER
2 g URA
22.5克LEU
注意：这是一种粉末。氨基酸溶液如上所述。
⁵⁹ Fe储备溶液

为了在ddH 2 O中制备20μM的工作原料： Fe Fe：
对于具有2个时间点和6个样品（单个小瓶）的实验，需要最少420μl的20μM Fe，因为每个样品（小瓶）需要70μl的20μM⁵⁹ Fe。建议在假设额外的1.5个样品的情况下计算所使用的 Fe溶液的量。对于这个例子，准备7.5 x 70微升，或525微升⁵⁹ Fe股票。这种预防措施确保即使有移液错误，也足以制定标准因此，对于525μl的20μM的59μLFe =3.03μl的3.47mM的59μL的Fe储备液（参见下面的注释）加上521.97μlddH 2 SO 4， O.因此，在每个小瓶中，70μl的在7ml摄取缓冲液中的20μM的59μLFe储备液=0.2μM ⁵⁹ Fe。
制备20μM⁵⁹ Fe原液的系列稀释液，使2和0.2μM原液用于标准品。
例如，100μl20μM⁵⁹ Fe +900μlddH 2 O =2μM⁵⁹ Fe。注意：

不要稀释从供应商收到的放射性核素的整个储存小瓶！只有在需要时才组成库存工作解决方案。
计算从供应商接收的放射性核素中的[⁵⁹ Fe]。给出了来自Perkin Elmer Life Sciences的产品号NEZ037001MC的实例。

将浓度除以比活度。这得到以mg/ml [（mCi/ml）/（mCi/mg）= mg/ml]表示的浓度。
例如，如果Perkin Elmer装有浓度为49.36mCi/ml的比活性为72.87mCi/mg的0.5mCi 59 Fe，则测定[^{59 Fe]按以下方式：
（49.36mCi/ml）/（72.87mCi/mg）= 0.67737mg/ml
（0.67737mg/ml）/（59g）= 0.01148mmol Fe/ml （0.01148mmol/ml）（1,000ml/L）= 11.48mM = [59] Fe]/该浓度是储存日期（制备^{59的批次的日期）。为了确定实验日期的浓度，请计算库存日期和实验日期之间的天数。使用⁵⁹ Fe衰减表，找到相应的衰减因子。通过股票日期校准乘以衰减系数。这给你在实验日期之前的储存小瓶中的[⁵⁹ Fe]。
为了测定⁵⁹ Fe储液瓶中的液体体积，将所订购的铁量（即<500>，500μCi）除以浓度（mCi/ml）铁发货后一周的日期。}}

10x淬灭缓冲液（1000ml）注意：不要过滤灭菌。
44.4g琥珀酸（最终浓度= 375mM） 75.6g Tris（终浓度= 625mM） 37.5g EDTA（酸形式）（最终浓度= 128mM）在添加所有三种化学品并调节pH之前，一切都不会进入溶液。
用NaOH
调节pH至6.0 将ddH <2> O加入到最终体积为1000ml
在4°C下储存在酸洗玻璃器皿
中稀释为1x，用于摄入量
柠檬酸盐摄取缓冲液（1,000ml）注意：在酸洗的玻璃器皿中制作并过滤灭菌此缓冲液。
20.0g分析葡萄糖（终浓度= 2％）
19.8g MES缓冲液（终浓度= 0.1M） 5.9g柠檬酸钠（终浓度= 20mM）加入NaOH调节pH至6.0
将ddH <2> O加入到最终体积为1000ml
过滤灭菌
在室温下贮存
酸洗玻璃器皿处理
将玻璃器皿浸泡在HNO <3> （3-6小时）
中注意：此过程可以在隔夜进行。
在去离子水中冲洗3次用水和高压灭菌器（铝箔盖）填充玻璃器皿的1/3。
倒出水，用水洗涤3次，
将玻璃器皿加满水（1/3满），再次高压灭菌（用铝箔盖上）在使用前倒出水

致谢

作者要感谢国家科学技术委员会（CNPq），法国国家高级委员会（CAPES）和基础设施委员会（FAPEG）。该方案的开发由来自DJK的美国国立卫生研究院（US）DK053820的资助支持。

参考文献

Bailão，E.F.L.C.，Lima，P.S.，Silva-Bailão，M.G.，Bailão，A.M.，Fernandes。 GR，Kosman，DJ and Soares，CMA（2015）。 Paracoccidioides spp。亚铁和三价铁同化途径。前微生物 6：821.

Eide，D.，Davis-Kaplan，S.，Jordan，I.，Sipe，D。和Kaplan，J.（1992）。酿酒酵母中铁摄取的调节。铁氧还蛋白和Fe（II）转运蛋白是独立调节的。 J Biol Chem 267（29）：20774-20781。

Kosman，DJ（2013）。 aerobes中的铁代谢：管理三价铁水解和亚铁自氧化。 Coord Chem Rev 257（1）：210-217。