材料和试剂

T25烧瓶（Coring，Falcon ，目录号：353108）
T75烧瓶（Coring，Falcon ^®，目录号：353136）
15ml离心管（Coring，Falcon ，目录号：352096）
6孔板（Coring，Falcon ，目录号：353046）
1.5ml Safe-Lock管（Eppendorf，目录号：0030120086）
96孔板（Coring，目录号：3799）
FACS管
肿瘤细胞系（在烧瓶中，在37℃和5％CO 2培养箱中生长）
RPMI 1640（Euroclone，目录号：ECM9106L）
在56℃热灭活1小时的胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco
设备
1. 离心机，使用最大加速和减速（Eppendorf，型号：5810R）
2. 将培养箱（5％CO 2，37℃）（Forma TM Supter-Cult TM CO 2 Sub培养箱 - Thermo Fisher Scientific）
3. 装有2个激光器（8个检测器）的流式细胞仪，使用DIVA软件版本6.1.3（BD，型号：FACSCanto II）
软件
1. DIVA软件版本6.1.3
2. FlowJo软件
程序
1. 肿瘤细胞系的酸处理
  1. 根据细胞类型，在37℃，5％CO 2培养箱中，在新鲜RPMI培养基中培养肿瘤细胞，细胞密度≥0.5-2×10 6细胞/ml， 2 。
  2. 在PBS（5ml）中洗涤贴壁细胞并通过在37℃，5％CO 2下在培养箱中加入833μMEDTA（1ml用于T25烧瓶和2ml用于T75烧瓶）3-5分钟来分离细胞。。
  3. 通过在468×g离心7分钟，用PBS（2×5ml，在15ml管中）洗涤细胞两次，并将它们重悬在冷的FACS缓冲液中。
  4. 用台盼蓝排除法计数总活细胞
  5. 在15ml管中用5ml PBS（在室温）收获5-10×10 6个细胞。
  6. 以468×g离心细胞7分钟。
  7. 弃去上清液，并通过手动轻轻摇动将细胞重悬在600μl冷酸缓冲液中。
  8. 在冰上孵育1至3分钟（应为每个细胞系进行初步实验以检测通过保持细胞活力来完全解离MHC I类复合物的最佳条件;完全解离将通过HLA I类的细胞表面表达来推导通过用mAb W6/32染色细胞检测的分子）
  9. 立即加入10ml完全RPMI（室温）。
  10. 以468×g离心细胞7分钟。
  11. 弃去上清液并将细胞重悬于10ml完全RPMI中。
  12. 以468×g离心细胞7分钟。
  13. 弃去上清液并将细胞重悬在1ml含有β2-微球蛋白（5μg/ml）的完全RPMI中。
2. 脉冲与肽
  1. 将细胞以1×10 6个细胞/孔的细胞密度接种在6孔板中。准备1个孔用于对照（无肽），1个孔用于待测试的每种肽和/或不同肽的混合物。
  2. 加入50μM肽（以10mM储备，单一或不同肽的混合物）
  3. 在RT孵育2小时，在37℃孵育2小时。
3. 染色和FACS分析
  1. 收获细胞在1.5毫升安全锁管和离心机在468×g下7分钟。
  2. 弃去上清液并将细胞重悬于100μl冷FACS缓冲液中
  3. 分布在圆底96孔板（50μl/孔）中
  4. 将板在832×g离心2分钟，在4℃
  5. 弃去上清液并将细胞重悬于50μl含有mAb W6/32（1:500稀释）的冷FACS缓冲液或50μl不含mAb的冷FACS缓冲液中; 小心混合。
  6. 在冰上孵育25分钟。
  7. 加入150μl冷FACS缓冲液，并在4℃下以832×g离心。
  8. 弃去上清液并将细胞再悬浮于含有山羊F（ab'）2片段抗小鼠IgG（H + L）-FITC（稀释1:100）的50μl冷FACS缓冲液中; 小心混合。
  9. 在冰上在黑暗中孵育25分钟。
  10. 加入150μl冷FACS缓冲液，并在4℃下以832×g离心。
  11. 丢弃上清液和重悬浮的细胞在150μlFACS管中的冷FACS缓冲液，并执行流式细胞术分析。通过在前向散射中选通来选择存活的人单个细胞相对于侧散射点图，细胞表面MHC I类表达的量将通过平均荧光强度（mfi）评估（图1）。用高亲和力肽的脉冲允许恢复酸处理的细胞的表面MHC I类表达
  12. 使用DIVA软件获取数据，并使用FlowJo软件进行分析
    
    图1.在用高亲和力肽脉冲的酸处理的DAOY细胞表面上回收肽-MHC I类复合物。在未处理的DAOY肿瘤细胞上表达的MHC I类的流式细胞术分析（蓝线）或用低pH缓冲液预处理以允许预形成的肽-MHC I类复合物解离（红线），然后用高亲和力肽（绿线）脉冲。同种型匹配的阴性对照抗体显示为黑色。
食谱
1. 完成RPMI
  440ml RPMI 1640
  50ml FBS
  5ml青霉素 - 链霉素 5ml L-谷氨酰胺
2. 833μMEDTA
  将7.3g EDTA溶于50ml无菌水中
  将pH调节至8.0
  将83.3μl该溶液加入50ml无菌PBS中通过20μm过滤器过滤灭菌
  存储在4°C
3. FACS缓冲区
  50 ml PBS
  1 g BSA
  酸性缓冲液
  在50ml无菌水中溶解2.52g Na 2 HPO 4（263mM）和1.29g一水合柠檬酸（123mM）。调节pH至2.5
致谢

此协议改编自Cifaldi等人。（2015）。我们承认意大利卫生部（意大利罗马）的资金和5 x 1,000意大利意大利安哥拉（意大利米兰）的特别项目。

参考文献
1. Cifaldi，L.，Romania，P.，Falco，M.，Lorenzi，S.，Meazza，R.，Petrini，S.，Andreani，M.，Pende，D.，Locatelli，F.and Fruci， 2015）。 ERAP1调节自然杀伤细胞功能，通过控制抑制性受体的结合。 Cancer Res 75（5）：824-834。