材料和试剂

50ml离心管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
15ml离心管（Corning，Falcon ，目录号：352095）
100mm培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353003）
无菌12ml注射器（COVIDIEN，Monoject ^TM，目录号：8881512878）
23 G×1"针（COVIDIEN，Monoject ^TM，目录号：8881200383）
3ml无菌注射器（COVIDIEN，Monoject ^TM，目录号：8881513934）
无菌1ml注射器（COVIDIEN，Monoject ^TM，目录号：目录号：8881501400）
1.5ml微管（Eppendorf，目录号：022-36-411-1）
注射器过滤器0.22μm，聚醚砜，33mm，γ灭菌（EMD Millipore，目录号：SLGV033RS）
无菌1x PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010-023）
Pierce Coomassie plus Bradford蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：23236）
10mg/ml抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A1153）
10mg/ml亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L9783）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
蛋白酶抑制剂混合物（参见Recipes）

设备

CO 2小鼠安乐死室（带流量计）（Euthanex，型号：E-20028）
-80℃冷冻器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Revco UXF）
分析天平（Mettler-Toledo International，型号：AE50）
冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Legend XFR）
冷藏微量离心机（Eppendorf，型号：5424R）
Vortex-Genie 2
超声波仪（热系统，型号：XL2010）

程序

以下过程描述从一只小鼠的大肠收集内容的步骤。该协议也可以适应于小肠内容物的收集。

使用CO 2安乐死室根据机构准则安乐死小鼠
切开腹部皮肤，不会中断腹膜（图1A）。
切开腹膜以暴露小肠和大肠（图1B）。
小心地将肠从腹部推出，并通过在胃后和尽可能低的结肠处切开来分离完整的小肠和大肠（图1C）。

程序

以下过程描述从一只小鼠的大肠收集内容的步骤。该协议也可以适应于小肠内容物的收集。

使用CO 2安乐死室根据机构准则安乐死小鼠
切开腹部皮肤，不会中断腹膜（图1A）。
切开腹膜以暴露小肠和大肠（图1B）。
小心地将肠从腹部推出，并通过在胃后和尽可能低的结肠处切开来分离完整的小肠和大肠（图1C）。
Tare analytical balance with empty 50 ml tube and adjust to zero. Weigh the tube with pelleted intestinal contents.
Resuspend the pellet in freshly prepared protease inhibitor cocktail (see Recipes) at a concentration of 2 g/ml.
Freeze pellet in -80 °C freezer for 20 min, then thaw for 20 min and vortex at maximum speed for 5 sec to disrupt bacterial cells. Repeat the freeze/thaw/vortex cycle two additional times.
To complete cell lysis, sonicate the contents for 30 sec on ice, followed by 30 sec rest on ice. Sonicate 5 times in total (use power setting #2 for up to 2 ml of sample with fixed vibration frequency at 20 KHz) (Figure 2).

Figure 2. Cell lysis of the intestinal contents by sonication. Following three freeze/thaw/vortex cycles, contents are sonicated on ice. The sonicator apparatus (A) and the procedure (B).
将内容物转移到1.5ml微量管中，并在4℃下以14,000×g离心30分钟。
吸出富含蛋白质的上清液（通常为1至2ml）而不干扰沉淀，并收集到置于冰上的15ml管中。
使用1ml注射器和0.22μm注射器过滤器对提取物进行灭菌（图3）

图3.提取物的灭菌。离心后，收集富含细菌的蛋白上清液/提取物，并通过0.22μm注射器过滤器。
使用Bradford蛋白质测定试剂盒或等同物，根据制造商的方案确定提取物的蛋白质浓度。我们建议对提取物进行纯净，1:10，1:100和1:1000稀释，以确保测定结果符合标准曲线。
用于体外刺激细胞的提取物的量可以根据实验设计而变化。在最初的文章（Horai等人，2015）中，10-500μg/ml的提取物用于在体外刺激视网膜特异性自身反应性T细胞。

数据分析

图4.代表性的结果 A.从蛋白质测定试剂盒（左）和从大肠和小肠获得的富含细菌的蛋白质提取物的典型最终蛋白质浓度产生的标准曲线（右）。 B.用提取物刺激20小时后诱导来自R161H小鼠的视网膜特异性T细胞与非特异性T细胞中的CD69表达（来自图6C，Horai等人，2015）。

食谱

蛋白酶抑制剂混合物
PBS补充：
10μg/ml抑肽酶
10μg/ml亮肽素 0.5mM苯甲基磺酰氟（PMSF）

致谢

这项工作是由国家眼科学院内部资助NEI/NIH（项目＃EY000184）支持。

参考文献

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