材料和试剂

材料
1. 电极（5mmΦ铂盘）（Nepa Gene，型号：CUY650P5）
2. 手术针（ELP，型号：CR13-50）
3. 玻璃毛细管（Warner Instruments，型号：GC150TF-10）
4. Nunc TM培养板（6孔）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：140675）。
5. Millicell培养板插入物（EDM Millipore，目录号：PICM03050）
6. Confetti（LCR膜过滤器）（EDM Millipore，目录号：FHLC01300）
7. 培养皿（60mm）（Sigma-Aldrich，目录号：Z721034）
  注意：此产品已停产。
8. 微量离心管（Sigma-Aldrich，目录号：Z666505）
9. 保护玻璃（MATSUNAMI GLASS）
10. 显微镜载玻片（MATSUNAMI GLASS）
11. 抽吸管组件（Drummond Scientific，目录号：2-000-000）
使用基于子宫内电穿孔的Supernova系统中的海马神经元的稀疏和明亮的标记（Mizuno等人，2014）
1. 怀孕老鼠（E13.5-E15.5）
2. Maxi-prep套件
3. 台盼蓝溶液（0.4％）（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
4. Supernova载体DNA溶液（pK036.TRE-Flpe-WPRE-pA和pK037.CAG-FRT-STOP-FRT-TurboRFP-ires-tTA-WPRE-pA）
5. 戊巴比妥（戊巴比妥钠）
6. 70％乙醇
7. 盐水
器官型海马切片培养
1. 鼠标啄（P4-P5）
2. MEM与gluramax-1（Thermo Fisher Scientific，目录号：41090-028）
3. EBSS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14155-048）
4. D-葡萄糖（NACALAI TESQUE，目录号：16805-35）
5. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15140-122）
6. 制霉菌素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15340029）
7. HEPES（1μM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630-080）
8. 马血清（Sigma-Aldrich，目录号：H1270-500ml）
9. 培养基（见配方）
10. 切片缓冲区（请参阅配方）
体外回缩测定
1. EphrinA3-Fc（R& D Systems，目录号：BT359）
2. 人Fc片段（Jackson ImmunoResearch，目录号：009-000-008）
3. 山羊抗人IgG，Fc片段特异性（Jackson ImmunoReserach，目录号：109-001-008）
4. 多聚甲醛（NACALAI TESQUE，目录号：02890-45）
5. PBS（ - ）
6. 使用DAPI（Vector laboratories，目录号：H-1200）的Vectashield封固介质

设备

稀疏和明亮的标记海马神经元使用在基于电泳的超声系统。
1. 电穿孔仪（Nepa Gene，型号：Nepa21）
2. 水浴
3. Puller（NARISHIGE Group，型号：PC-10）
4. 加热台（Leica Biosystems，型号：HI1220）
5. 外科工具（剪刀，12厘米）（Fine Science Tools，目录号：14001-12）
6. 外科工具（剪刀，10.5cm）（Fine Science Tools，目录号：14088-10）
7. 手术工具（镊子，12cm）（Fine Science Tools，目录号：11000-12）
8. 手术工具（镊子，10厘米）（Fine Science Tools，目录号：11050-10）
9. 手术工具（环形钳，8.5cm）（Fine Science Tools，目录号：11101-09）
器官型海马切片培养
1. LinearSlicer（Dosaka，型号：PRO7）
2. 37℃，5％CO 2培养箱
3. 移液器
体外回缩测定
1. 25℃培养箱
成像和分析
1. 共聚焦显微镜（Leica Biosystems，型号：TSC-SP5）
2. Imaris细丝示踪剂（位平面）

软件

Imaris

程序

使用基于子宫内电穿孔的Supernova系统中的海马神经元的稀疏和明亮标记
注意：强烈建议使用Supernova系统，使用稀疏和明亮的细胞标记与少量背景分析精细结构，如个别神经元的刺。超新系统在别处描述（Mizuno等人，2014）。简言之，该系统使用两个载体TRE-Flpe-WPRE-pA（pK036）和CAG-FRT-STOP-FRT-TurboRFP-ires-tTA-WPRE-pA（pK037）。在携带两种载体的小群神经元中，TRE渗漏驱动来自第一载体的弱但超过阈值的Flp1表达，随后在几个拷贝的第二载体中去除FRT-STOP-FRT盒，并且弱表达的tTA。然后，仅在这些稀疏的神经元中，tTA与TRE结合并诱导强Flp表达，这导致从第二载体的许多拷贝中去除FRT-STOP-FRT盒，并且最终通过正反馈导致极强的RFP表达。基于Flip的Supernova载体[TRE-Flpe-WPRE-pA（pK036）和CAG-FRT-STOP-FRT-TurboRFP-ires-tTA-WPRE-pA（pK037）（ tiwasato@nig.ac.jp ）。
1. 为了制备微量移液器，在以下条件下使用拉片拉玻璃毛细管：两步;加热器，65-75;重量1-3。用适当直径（约20μm）的钳子切掉尖端。
2. 为了制备用于Supernova标记的DNA溶液，使用不含内毒素的Maxi纯化质粒组，TRE-Flpe-WPRE-pA（pK036）和CAG-FRT-STOP-FRT-TurboRFP-ires-tTA-WPRE-pA（pK037） -prep试剂盒，并将其混合至1μg/μlpK036和50ng /μlpK037的终浓度。
3. 等分40μl的DNA溶液，并加入4μl台盼蓝溶液（0.4％）
4. 通过腹膜内注射（50mg/kg盐水）麻醉怀孕小鼠（E13.5-E15.5）与戊巴比妥钠。
5. 将麻醉的鼠标放在工作板上，用70％乙醇洗腹部
6. 使用剪刀在腹部中线切口，并轻轻地取出子宫到盐水润湿的纱布上。在手术过程中，用预温热的盐水保持子宫湿润（图1）
  
  图1.麻醉的怀孕小鼠胚胎（E14.5）
7. 使用带吸气管的微量吸管将1-2μl的DNA溶液注入胚胎的目标心室。
8. 用电极保持胚胎（图2：在胚胎头的注射侧上的负电极），并施加电脉冲[40-50V，P在50毫秒，P在950毫秒（1Hz），5次] br />
  
  图2.子宫内电穿孔的示意图。DNA注射侧（蓝色）和海马电穿孔的电极的相对位置。
9. 将子宫轻轻地放入腹腔。
10. 用预热的盐水填充空腔。
11. 使用手术针和线缝合外科切口
12. 将鼠标放在37℃的加热台上，直到麻醉恢复
器官型海马切片培养
1. 将1ml培养基倒入每个孔（6孔板）
2. 将Millicell培养板插入每个孔。
3. 使用剪刀（四分之一）切割五彩纸屑，并在每个插入件上放一块
4. 将板置于37℃的5％CO 2培养箱中
5. 将10ml切片缓冲液倒入Falcon管（50ml）中，并保持在冰上
6. 在冰上将5ml切片缓冲液倒入培养皿（60mm）中
7. 使用剪刀斩首安乐死小狗（P4-P5）。
8. 将大脑放入含有在冰上的切片缓冲液的培养皿中
9. 摘除小脑后沿中线切开大脑一半。
10. 在LinearSlicer缓冲盘的台上粘贴脑组织。
11. 使用切片缓冲液（4°C）填充缓冲液托盘。
12. 切割300微米海马切片（矢状切片）使用LinearSlicer。留下内嗅皮层附着海马（图3）。
  
  图3.来自大脑的海马的解剖。左图：通过vibratome对P5小鼠脑进行矢状切片。右：示出了300μm厚的切片和切割位置
13. 收集切片在含有切片缓冲液（4℃）的50ml Falcone管中
14. 使用移液管从管中取一片，并将其放在插入的五彩纸屑的中心
15. 从插入物中除去过量的缓冲液，并将板置于5％CO 2培养箱（37℃）中。
16. 每2天更换培养基，直到收缩测定。
体外回缩测试
1. 在微量离心管中混合10μgephrinA3-Fc/Fc和45μg抗人Fc抗体。
2. 将管置于25℃的培养箱中。
3. 1小时后，将预聚集的溶液放入器官型海马切片培养基中。 ephrinA3-Fc/Fc的最终浓度为10μg/ml
4. 将板置于37℃的5％CO 2培养箱中
5. 16小时后，用4％PFA的PBS溶液在室温下将海马切片固定在五彩纸屑片上30分钟。
6. 用Vectashield固定介质将海马切片装载到载玻片上，并用盖玻片覆盖
成像和分析
1. 图像树突棘在海马锥体神经元CA1区域使用共聚焦显微镜的初级/次级树突。连续z-图像由具有0.1μm间隔的光学截面（1,024×1,024像素）组成，使用具有9x数字变焦的63x油浸物镜（数值孔径，1.3）。图4显示了典型树突棘的z-堆积图像
2. 重建z图像，并测量脊柱密度，脊柱长度，体积由Imaris长丝示踪剂。
  
  图4.树突棘回缩测定结果的实施例在用ephrinA3-Fc（右）或Fc（左）处理后来自海马切片的树突的区段。比例尺：10μm。

食谱

培养基
250ml含glutamax-1的MEM 125毫升马血清
120ml含有3％D-葡萄糖的EBSS 5ml青霉素 - 链霉素 0.3ml制霉菌素
切割缓冲区
487.5ml EBSS
12.5 ml 1 M HEPES

致谢

该协议从Iwata等采用。（2015）。这项工作由JSPS KAKENHI（15H04263,16K14559）和MEXT KAKENHI（15H01454）支持。

参考文献

Iwata，R.，Matsukawa，H.，Yasuda，K.，Mizuno，H.，Itohara，S。和Iwasato，T。（2015）。发育RacGAPα2嵌合蛋白信号传导是成年树突棘形态学特征的决定因素。 J Neurosci 35（40）：13728-13744。
Mizuno，H.，Luo，W.，Tarusawa，E.，Saito，YM，Sato，T.，Yoshimura，Y.，Itohara，S。和Iwasato，T。（2014）。 NMDAR调节的层4神经元树突的动态在新生儿的脑皮层重组过程中。 em> Neuron 82（2）：365-379。