材料和试剂

一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：13-678-20B）
灭菌袋（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：01-812-51）
6孔板（Corning，Falcon ，目录号：353046）
0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGP033RS）
0.45μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHV033RS）
24孔板（Corning，Falcon ，目录号：353047）
成年小鼠（Mus musculus;≥6周龄）
马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：26050-088）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖，丙酮酸盐（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11995-065）}
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）（1μM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15630-080）}
青霉素 - 链霉素（Pen/Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140-122）
胶原酶II（Worthington Biochemical Corporation，目录号：LS004176）
超纯水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10977-015）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010-023）
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）。
100％乙醇（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：2701）
Tris碱（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
重组人成纤维细胞生长因子 - 碱性（bFGF）（PeproTech，目录号：100-18B）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10437-028）
鸡胚提取物（CEE）（抗体生产服务，目录号：MD-004E）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
100％Triton X-100（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP151-500）
甘氨酸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP381-5）
5％（w/v）叠氮化钠（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：71448-16）
第一抗体抗MyoD（兔）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-304）
初级抗体抗Pax7（小鼠）（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：PAX7）
第二抗体山羊抗兔Alexa Fluor 488缀合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11034）
第二抗体山羊抗小鼠Alexa Fluor 568缀合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11004）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）
胶原酶II（参见配方）
消化介质（参见配方）
洗涤液（见配方）
70％乙醇（见配方）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（参见配方）
鸡胚提取物（CEE）（参见食谱）
肌纤维生长培养基（MfGM）（参见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（参见配方）
10％Triton X-100（参见配方）
淬火溶液（参见配方）
阻止解决方案（参见配方）

设备

水浴（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：15-462-15Q）
显微镜（Nikon Instruments，型号：TE2000）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：3578）。

程序

在隔离肌纤维之前
1. 硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管末端对于肌纤维来说太锋利。火焰抛光使端部平滑，然后高压灭菌（见注1）
2. 在灭菌袋中高压灭菌一套包含一把小剪刀和镊子的工具，用于从小鼠后肢取出长伸肌（EDL）肌肉。
3. 用约1ml马血清（马血清用于研究卫星细胞活化，因为它保持肌纤维悬浮）涂覆6孔板。让板放置1分钟，然后除去多余的（你可以放回原来的瓶子重复使用多次，如果保持无菌）。避免气泡。将板开放干燥（干燥需要〜20分钟）。关闭板一旦它们被干燥并且在室温下在通风橱下留下，直到准备使用。这些板将用于在用胶原酶消化EDL肌肉后分离和培养肌纤维。
4. 按照配方，准备消解培养基（见注2）
5. 按照食谱，准备胶原酶II（见注3）
6. 按照配方，准备洗涤溶液。为了在消化前洗涤EDL肌肉，制备6孔板，每孔3ml的洗涤溶液。每个孔对于一对EDL肌肉（右和左）是特异性的。每对EDL将有3次洗涤
肌肉去除和洗涤
1. 通过以250mg/kg的剂量IP注射Avertin（2,2,2-三溴乙醇），然后颈脱位来安乐死小鼠。
2. 在整个身体上喷洒70％乙醇，并将小鼠面朝上。
3. 在后肢区域剃刮头发，并使用高压灭菌剪刀和镊子轻轻取出皮肤（见注4）。
4. 小心移除围绕右胫前肌（TA）肌肉的筋膜（视频1）
  <！ - flashid1942v101开始 - >
  视频1.从小鼠中分离EDL肌肉的分步程序
  
  <！ - flashid1942v101结束 - >
5. 小心去除TA肌肉，而不损伤EDL肌肉下面（见注5）。第一个去除的肌肉是可以丢弃的TA肌肉（视频1）
6. 仔细去除EDL肌肉（图1）。视频1中去除的第二肌肉是EDL肌肉。避免在隔离期间和隔离后拉伸肌肉（见注释5-7）。
7. 将EDL肌肉放入含有洗涤溶液的孔中（第一次洗涤）
8. 执行另一侧EDL的隔离（尝试在接下来的5分钟内执行此步骤）。
9. 将EDL肌肉放在与其他EDL肌肉相同的井中。
  
  图1.来自小鼠的EDL肌肉的分离 A.这里呈现的图片描绘了TA（黑色箭头）和EDL（绿色箭头）肌肉的腱; B.移除TA肌肉后的小鼠后肢。箭头指向EDL肌肉的腱; 将EDL肌肉从腱分离为腱; D.通过切割远端肌腱来分离EDL肌肉。
10. 将6孔板用70％乙醇喷洒在生物安全柜下。
11. 进行第二次和第三次洗涤（每次30秒），通过将EDL肌肉转移到包含洗涤溶液的下一个孔
肌肉消化
1. 根据配方，通过添加400 U/ml胶原酶II到消化培养基的基础完成消化培养基的制备。用0.22μm过滤器过滤消解介质。
2. 取一个新的6孔板，每孔加入5毫升消化培养基（两个EDL肌肉）
3. 取高压灭菌镊子，从用于洗涤的6孔板中清除EDL肌肉，并将其放入含有消化培养基的6孔板中。
4. 将含有EDL肌肉的6孔板在设定为37℃和5％CO 2的CO 2培养箱中放置1.5小时至2小时。在消化第一小时后，通过将6孔板置于倒置显微镜下并观察是否单个肌纤维从EDL肌肉释放，检查消化EDL肌肉的状况（参见注释8）。使用无菌牧场移液管和消化介质，轻轻研磨EDL肌肉加速单肌纤维的解离。避免过度消化胶原酶（图2）。过度消化通常导致高收缩肌纤维的分离（见注9）。
  
  图2.使用胶原酶消化EDL肌肉。本文提供的代表性相差显微镜图像显示了在不同胶原消化阶段（上图）的良好质量EDL肌肉的形态。左上图显示了EDL肌肉在消化前的紧密捆束纤维。上中图像显示在胶原酶处理开始约45分钟时结缔组织的部分解离。右上图描述了从EDL肌肉完全消化和释放肌纤维。下图显示了在不适当分离的EDL肌肉中肌肉消化的相应阶段。比例尺=100μm。
肌纤维的分离和培养
1. 按照食谱，准备肌纤维生长培养基（MfGM）
2. 用马血清（马血清防止肌纤维粘在玻璃吸管）涂覆高压灭菌的巴斯德吸管。
3. 取一个新的6孔板，每孔放2毫升MfGM（EDL肌肉消化后中和胶原酶活性）。
4. 从培养箱中取出含有EDL肌肉的6孔板。在显微镜下观察EDL肌肉，以确保单肌纤维的正常结构和形状
5. 转移消化的EDL肌肉（使用高压灭菌火焰抛光的巴斯德吸管）到一个新的6孔板，包含2毫升MfGM在三个井（见注10）。
6. 转移消化的EDL肌肉从一个井到下一个连续的方式用高压灭菌的巴斯德吸管。允许消化的EDL's设置在每个3个孔中30秒。这将中和胶原酶酶活性并停止消化过程。
7. 取先前用马血清包被的6孔板，并每孔加入3ml MfGM（用于培养肌纤维）。
8. 在包含MfGM（即，孔＃1）的包被的6孔板中转移中和的EDL肌肉。使用高压灭菌包衣牧场吸管，轻轻冲洗EDL肌肉和肌纤维束与MfGM。不要剧烈磨损肌肉，因为它可能导致肌纤维损伤（见注11）。
9. 将EDL肌肉从＃1井转移到＃2井。用高压灭菌的涂覆的巴斯德吸液管轻轻地冲洗EDL
10. 将EDL肌肉从井＃2移动到井＃3，并重复相同的过程，直到井＃6。目标是在每个井中使用来自EDL肌肉的肌纤维。孤立单肌纤维的代表性图像如图3所示。
  
  图3.正常和超收缩的单独单肌纤维培养物的图像。左图表示成功分离后的孤立单肌纤维。纤维大多是直的和半透明的，它们的表面没有任何剪切或撕裂。右图显示了不充分制备后的纤维形态。红色箭头指向超收缩纤维，而蓝色箭头指向断裂纤维。比例尺=100μm。
11. 在显微镜下观察EDL肌纤维的形状和结构（见注12）
12. 将含有EDL肌纤维的6孔板置于设定在37℃和5％CO 2的CO 2培养箱中。如果需要在静止期分析卫星细胞，立即固定肌纤维并进行染色。为了研究卫星细胞的激活，培养肌纤维达到所需的时间点。通常，在分离后72小时观察到大的卫星细胞簇
卫星细胞对Pax7和MyoD蛋白的免疫染色
1. 用移液管，小心地删除2毫升MfGM，留下1毫升与肌纤维（见注13）。
2. 通过加入1毫升4％PFA到每个含有肌纤维的孔中并在室温（RT）下孵育5分钟来固定肌纤维。
3. 用移液管，小心地去除MfGM和4％PFA，将肌纤维留在孔中。
4. 向每个孔中加入1ml的4％PFA。在RT孵育平板10分钟。
5. 小心地清除4％PFA溶液，同时将光纤放在孔内。
6. 用1ml PBS洗涤含有肌纤维的每个孔。在室温下孵育5分钟。小心取出PBS离开孔内的肌纤维。重复此步骤2次（2 x 5分钟）。
7. 准备淬火溶液。
8. 向每个孔中加入2ml淬灭溶液。在室温下孵育7至10分钟。
9. 小心地清除淬火溶液，将肌纤维留在井内
10. 用1ml PBS洗孔。在室温下孵育5分钟。取出PBS，离开肌纤维在井内。重复此步骤3次（3 x 5分钟）。
11. 准备封闭溶液。
12. 向每个孔中加入1ml封闭溶液。在室温下孵育60分钟。
13. 使用牧场移液管，将肌纤维从6孔板转移到24孔板（以使所用试剂的量最小化）。
14. 在封闭液中制成1:100稀释的MyoD抗体。类似地，在封闭溶液中制备Pax7抗体的1:5稀释液。
15. 小心地除去阻塞溶液，同时将光纤放在孔内。
16. 加入100微升每个稀释的抗体溶液每孔的24孔板含有肌纤维。之后，抗MyoD的最终稀释度为1:200，抗Pax7将为1:10。将板在4℃下孵育过夜。
17. 第二天，从每个孔中移除初级抗体溶液，同时将肌纤维留在孔内
18. 在24孔板的每个孔中加入200μlPBS以洗涤肌纤维。在室温下孵育5分钟。从孔中取出PBS，加入新鲜的PBS。重复此步骤3次（3 x 5分钟）。
19. 在封闭溶液中制备1：1,500稀释的两种第二抗体（即山羊抗兔Alexa Fluor 488缀合物和山羊抗小鼠Alexa Fluor 568缀合物）。
20. 在孔中加入200μl次级抗体溶液。在室温下避光孵育60分钟。
21. 从每个孔中移除二抗，同时留下肌纤维
22. 在每个孔中加入200μlPBS，并在室温下孵育5分钟。小心取出PBS，并留在井内的肌纤维。重复此步骤3次（3 x 5分钟）。
23. 制备1：5,000稀释的DAPI在PBS中
24. 在每个孔中加入200μl稀释的DAPI溶液。在室温下避光孵育3分钟。
25. 从每个井中取出DAPI，留下肌纤维内。
26. 在每个孔中加入200μlPBS。在室温下孵育5分钟。取出PBS，同时将肌纤维留在孔内。重复此步骤2次（2 x 5分钟）。
27. 最后，在每个孔中加入200μlPBS
28. 分析肌纤维相关卫星细胞表达的MyoD（绿色）和Pax7（红色）在荧光显微镜下。使用该方案产生的代表性个体抗MyoD，抗Pax7，DAPI染色和合并图像已经在我们最近的出版物中发表（Hindi和Kumar，2016; Ogura等人，2015）。培养72小时后卫星细胞簇在肌纤维上染色的代表性图像示于图4中
  
  图4.对于Pax7和MyoD蛋白质的肌纤维相关卫星细胞的染色。在72小时后，用抗Pax7，抗MyoD和DAPI染色的肌纤维相关卫星细胞簇的代表性个体和合并图像的培养。比例尺=100μm。

数据分析

对于单个实验，样品大小应通过功率分析确定。对于我们的大多数研究，我们使用每组3-5只小鼠。对于Pax7 ⁺或MyoD ⁺细胞的分析，强烈建议从每只小鼠的每个EDL肌肉分析18-22个肌纤维。数据作为Pax7 /MyoD ^-，Pax7 ⁺/MyoD ⁺的平均数收集，Pax7 < sup> - /MyoD ⁺细胞。这些数字用于计算每组中不同小鼠的平均值。我们将数据表示为平均值±标准差（SD）。我们使用配对或不配对的学生检验来确定不同组之间的统计差异，类似于所述（Hindi和Kumar，2016; Ogura等人，2015; Ogura等人， em>等人，2013）。 A 0.05被认为具有统计学意义。

笔记

重要的是使用玻璃巴斯德移液管，其中它们的末端被火焰平滑。尖端巴斯德吸管在后续步骤中的拾取和处理过程中可能损坏肌纤维。
此时不要添加胶原酶以保持酶活性。
胶原酶等分试样可以提前制备并储存在-20℃
使用无菌手术工具以避免培养物的污染，特别是长期分析是至关重要的
确保剪刀的锋利边不面对肌肉表面，因为这可能剪切和损坏肌肉
为了获得未受损的肌纤维，有必要在肌肉去除过程中将EDL肌肉从腱分离为腱。
在任何步骤处理EDL肌肉时，请确保通过其远端肌腱保持它，避免挤压或从中腹部抓住它。
试图在肌肉充分消化之前从EDL中研磨或释放肌纤维将使肌纤维受到机械损伤，因为需要更大的研磨力，这将降低健康肌纤维的产量。
来自野生型C57BL6小鼠的EDL肌肉在2小时内消化。然而，一些其他菌株可能需要更长或更短的时间来进行充分消化。强烈建议在显微镜下监测肌肉的消化。肌肉的过度或过度消化将导致在随后的步骤期间肌细胞的死亡和较差的产量。
在这一步，不要让消化的肌肉吸入牧场移液管，因为这可能会损坏肌纤维。
一旦一些肌纤维已经释放到一个孔中的培养基中，不要在同一个孔中继续研磨过程以释放更多的肌纤维，因为先前释放的肌纤维可能在试图从肌肉解离更多肌纤维的过程中被损坏。为此，立即将肌肉转移到组织培养板的下一个孔，并继续研磨过程以释放更多的肌纤维。继续此过程，直到可以释放最大数量的肌纤维
健康肌纤维应该看起来半透明，没有损伤或剪切的迹象。在高放大倍率下可以在肌纤维的表面上观察到规则的条纹
在固定肌纤维之前除去整个生长培养基可能导致肌纤维的弯曲或收缩，因此建议向肌纤维中加入4％PFA，同时仍然在剩余量的生长培养基中以保持形态和结构完整性。

食谱

胶原酶II 在超纯水中制备4,000 U/ml原液
消化培养基

通过用2.5％HEPES和1％青霉素（Pen）/链霉素（Strep）溶液补充DMEM制备消化培养基的底物。保持在37°C在水浴中，直到准备好使用。
一旦肌肉已被分离并准备消化，添加胶原酶II，使最终浓度为400 U/ml。用手轻轻摇动。
使用前，使用0.22μm过滤器过滤消解介质注意：对于两个EDL肌肉，准备5ml消化介质。

洗涤溶液
PBS，1％Pen/Strep
70％乙醇
将700ml 100％乙醇与300ml去离子水混合
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
在1ml含有0.1％BSA的5mM Tris（pH7.6）中稀释50μgbFGF（50μg/ml）。
鸡胚提取物（CEE）
在含有冻干CEE（50μg/ml）的瓶中加入10ml PBS
肌纤维生长培养基（MfGM）
补充含有10％FBS，1％Pen/Strep，2％CEE和10ng/ml bFGF的DMEM。在37℃下在水浴中温育MfGM 使用前，用0.22μm过滤器过滤MfGM 注意：对于两个EDL肌肉，准备36ml的MfGM。
4％多聚甲醛（PFA）
将0.4g PFA在10ml PBS中稀释在60℃和250rpm下剧烈振荡1-2小时，直至完全溶解使用前，用0.45μm过滤器过滤4％PFA
10％Triton X-100 将100μl100％Triton X-100与900μlPBS混合
淬火溶液
对于10ml溶液，将75.07mg甘氨酸与200μl10％Triton X-100和50μl5％叠氮化钠组合。
用PBS完成10ml。
封锁解决方案
对于10ml溶液，将200mg BSA与200μl10％Triton X-100和500μl马血清合并。
用PBS完成10ml。
使用前，用0.45μm过滤器过滤阻塞溶液。

致谢

这项工作得到了来自NIH授权AR059810，AR068313和AG029623（到A.Kumar）和AR069985（到S.M.P Hindi）的资助。

参考文献

Anderson，JE，Wozniak，AC and Mizunoya，W.（2012）。用于细胞，分子，药理学和进化研究的单一肌纤维分离和培养。方法Mol Biol 798：85-102。

Bischoff，R。（1986）。肌肉卫星的增殖细胞在培养物中的完整肌纤维上。 Dev Biol 115（1）：129-139。

印度语，SM，Paul，PK，Dahiya，S.，Mishra，V.，Bhatnagar，S.，Kuang，S.，Choi，Y.和Kumar，A。（2012）。 TRAF6和缺刻信号之间的相互作用调节成年肌纤维再生损伤。 Mol Cell Biol 32（23）：4833-4845。

Hindi，SM和Kumar，A.（2016）。 TRAF6调节卫星干细胞自我更新和再生性肌发生期间的功能。 126（1）：151-168。

Kuang，S.，Charge，SB，Seale，P.，Huh，M.and Rudnicki，MA（2006）。

Kuang，S. and Rudnicki，MA（2008）。卫星细胞的新兴生物学及其治疗潜力。趋势Mol Med 14（2）：82-91。

Keire，P.，Shearer，A.，Shefer，G.and Yablonka-Reuveni，Z.（2013）。分离和培养骨骼肌肌纤维作为分析卫星细胞的方法。 Methods Mol Biol 946：431-468。

Le Grand，F。和Rudnicki，MA（2007）。 Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis。Curr Opin Cell Biol 19（6）：628-633。

Ogura，Y.，Hindi，SM，Sato，S.，Xiong，G.，Akira，S. and Kumar，A。（2015）。 TAK1调节卫星干细胞内环境稳定和骨骼肌修复。 Nat Commun 6：10123.

Ogura，Y.，Mishra，V.，Hindi，SM，Kuang，S.和Kumar，A.（2013）。从成体骨骼肌分离和培养个体肌纤维和它们的卫星细胞。（73）：e50074。

Rosenblatt，JD，Lunt，AI，Parry，DJ和Partridge，TA（1995）。从活单肌纤维外植体培养卫星细胞。 In Vitro Cell Dev Biol Anim 31（10）：773-779。

Shefer，G.和Yablonka-Reuveni，Z。（2005）。骨骼肌肌纤维的分离和培养作为分析卫星细胞的手段。
Methods Mol Biol 290：281-304。

Siegel，AL，Atchison，K.，Fisher，KE，Davis，GE和Cornelison，DD（2009）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih。 gov/pubmed/19609936"target ="_ blank">肌肉卫星细胞运动性的3D时间间隔分析。干细胞 27（10）：2527-2538。

Verma，M.和Asakura，A。（2011）。用于卫星细胞检测的β-半乳糖苷酶染色后，从酒精固定的成体肌肉中分离有效的单一肌肉纤维。 59 Histochem Cytochem 59（1）：60-67。