材料和试剂

重组蛋白
1. 来自 Tribolium castaneum的活动PINK1 [MBP标记] （Ubiquigent，目录号：66-0043-050）
2. Inactive PINK1 D359A [MBP-tagged] from Tribolium castaneum （Ubiquigent，目录号：66-0044-050）
3. Parkin（未标记）（Ubiquigent，目录号：63-0048-025）
4. 泛素（未标记）（BOSTON BIOCHEM，目录号：U-100H）
5. 泛素N-末端生物素（BOSTON BIOCHEM，目录号：UB-560）
6. 生物素化多泛素链（K48连锁）（BOSTON BIOCHEM，目录号：UCB-230）
7. 聚泛素链（K63连接）（生物素化）（BOSTON BIOCHEM，目录号：UCB-330）
缓冲剂化学品
1. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
2. DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
3. 乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
4. EDTA（EMD Millipore，目录号：EX0539）
5. ATP（AppliChem，目录号：A1348）
6. 氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M0250）
7. 氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：60370）
8. Tris（Santa Cruz Biotchnology，目录号：sc-3715）
9. 盐酸（37％）（EMD Millipore，目录号：1003172500）
10. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509）
11. 甘油（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP2291）
12. β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
13. 溴酚蓝钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
14. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
15. 甲醇（Pharmco-Aaper，目录号：339000000）
16. 奶粉
17. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
18. 氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP358-10）
19. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
20. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
21. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
22. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
23. 10x激酶缓冲液（参见配方）
24. 6x SDS上样缓冲液（见配方）
25. SDS运行缓冲液（参见配方）
26. 印迹缓冲液（参见配方）
27. TBST（参见配方）
28. 解决凝胶缓冲液（参见配方）
29. 14％分离的磷标记凝胶（微型凝胶配方）（参见配方）
30. 8％分离的磷标记凝胶（微型凝胶配方）（参见配方）
31. 堆叠凝胶缓冲液（参见配方）
32. 堆叠凝胶（两个迷你凝胶的配方）（参见配方）
33. Phos标记凝胶洗涤缓冲液1（见配方）
34. Phos标记凝胶洗涤缓冲液2（见配方）
35. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
36. 抗原检索溶液（见配方）
SDS-PAGE/Western印迹
1. 8-16％Tris-甘氨酸凝胶（用于Parkin）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：EC60485BOX）}
2. 16％Tris-甘氨酸凝胶（用于泛素）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：EC64985BOX）}
3. 预染色蛋白梯（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610394）
4. PVDF膜（EMD Millipore，目录号：IPVH00010）
5. pS65-Parkin抗体（Abcam，目录号：ab154995）
6. pS65-泛素抗体（EMD Millipore，目录号：ABS1513-I或BOSTON BIOCHEM，目录号：A-110）
7. 单克隆Parkin抗体Prk8（Cell Signaling Technology，目录号：4211）
8. 单克隆泛素抗体（LifeSensor，目录号：VU-101）
9. HRP-连接的（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：21130）的Pierce TM链霉亲和素
10. HRP缀合的抗兔抗体（Jackson Immunoresearch，目录号：111-035-003）
11. HRP缀合的抗小鼠抗体（Jackson Immunoresearch，目录号：115-035-003）
12. Western印迹检测试剂（EMD Millipore，目录号：WBKLS0500）
13. X射线胶片（Genesee Scientific，目录号：30-101L）
14. 丙烯酰胺：双丙烯酰胺19:1，溶液40％（w/v）（EMD Millipore，目录号：1290-OP）
15. 氯化锌（ZnCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：96468）
16. 过硫酸铵[（NH 4）2 SS 2 O 8]（Sigma-Aldrich，目录号：A9164 ）
17. TEMED（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-29111）
18. Phos-tag ^{TM 丙烯酰胺AAL-107（Wako Pure Chemical Industries，目录号：304-93521）}
19. 25％戊二醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G6257）

设备

标准台式离心机
用于微管的加热摇床[例如，Thermomixer（Eppendorf，目录号：5384000020）]
SDS-PAGE凝胶电泳和印迹盒（例如，VWR International，Peqlab，目录号：45-1010-C和Bio-Rad Laboratories，目录号：1704070）
用于Western印迹的轨道振动器
X射线胶片处理器或照相机检测系统（例如GE Healthcare，目录号：28-9558-10）以显现化学发光的Western印迹信号

软件

ImageJ或ImageStudio Lite

程序

激酶反应
1. 准备10x激酶缓冲液。
  注意：10x激酶缓冲液应始终新鲜制备。它可以从更高浓度的储备溶液混合在一起。我们建议冷冻小（一次使用）等分的ATP和DTT。
2. 在冰上解冻重组蛋白
3. 在干净的微管中，将PINK1与泛素（单体或链）或Parkin混合：使用0.1-1μgPINK1 /μg泛素或Parkin。
  注意：
4. 可选：如上所述制备阴性对照样品，但使用无活性的PINK D359A代替野生型酶
5. 加入激酶缓冲液至终浓度为1x
6. 在4℃下在1,000×g下旋转反应10秒
7. 在37℃的加热振荡器中孵育反应60-120分钟（或24-48小时以实现100％底物磷酸化）。
8. 通过加入6x SDS上样缓冲液至终浓度为1x来终止反应。
9. 在56°C孵育反应15分钟。
  注意：这个较低的温度防止了不需要的自发形成泛素"二聚体"
使用磷酸特异性抗体的检测
1. 将SDS凝胶装入电泳室。
2. 用1×SDS运行缓冲液填充室
3. 将样品装载到凝胶上。每通道使用20-500 ng。
  注意：作为一个起点，我们建议使用50 ng。根据检测方法（抗体，稀释液等）和设备，可能会改变数量。
4. 在一个泳道中加入5-10μl预染色的蛋白梯度作为分子量标记
5. 使用标准条件（对于下面列出的凝胶/设备使用恒定125伏90分钟）运行凝胶
6. 使用标准条件（对于下面列出的凝胶/设备使用恒定100伏50分钟），在1×印迹缓冲液中将凝胶转移到甲醇活化的PVDF膜上。
7. 将膜在5％干奶粉中在TBST中在室温下摇动1小时注意：我们常规使用TBST进行Western印迹。其他洗涤缓冲液也可以工作，但磷酸盐缓冲液通常不推荐用于检测磷酸化蛋白质。
8. 将膜与在5％BSA的TBST中稀释的磷酸特异性遍在蛋白或Parkin抗体在4℃孵育过夜。
  注意：以下列出的磷酸化特异性抗体尚未针对此特定方法进行测试。抗体的最终浓度取决于加载量，必须根据经验确定。
9. 在室温下在TBST中洗涤膜4×10分钟
10. 将膜用在TBST中的5％奶粉中1:10,000稀释的二抗在室温下孵育1小时
11. 在室温下在TBST中洗涤膜4×10分钟
12. 根据制造商的说明用检测试剂孵育膜。
13. 通过暴露X射线胶片或使用相机检测系统来开发Western印迹
使用phos标签凝胶检测
注意：该方法不依赖于磷酸特异性抗体的可获得性/性能。与未修饰的蛋白相比，磷酸化蛋白在磷酸标记凝胶中迁移更慢，导致带移。如果生物素化的重组底物用于激酶反应，则可以用针对未修饰的目的蛋白的特异性抗体或用HRP偶联的链霉亲和素来显现它们。
1. 制备所需密度的phos-tag聚丙烯酰胺凝胶：分别为8％的Parkin和14％的单泛素。
2. 继续如上所述的SDS-PAGE 注意：
  1. 在冰中或用设备的冷水灌注运行凝胶[对于下面列出的设备分别使用恒定125伏特90分钟（8％凝胶）和120-140分钟（14％凝胶）]。
  2. 预染色的蛋白质标记通常导致畸变，因为它们含有EDTA或磷酸化蛋白质。在标记和样品之间至少要有一个通道留空。请注意，预先染色的标记物的分子量在phos-tag凝胶上将不准确。
3. 电泳后，在phos-tag洗涤缓冲液1中孵育phos-标签凝胶20分钟，然后在室温下在phos-tag洗涤缓冲液2中孵育两次，每次20分钟。
4. 在1×印迹缓冲液中将凝胶转移到甲醇活化的PVDF膜上（对于下面列出的设备，使用恒定105伏60分钟）。
  注意：可以使用硝化纤维素膜代替PVDF。
5. 对于一些一抗，抗原修复是必要的。泛素抗体VU-1需要用超纯水洗涤膜，然后在0.5％戊二醛处理20分钟，摇动，然后用PBS短暂洗涤三次。
6. 在室温下在TBST中对于VU-1和Prk8抗体在5％干奶粉中和在与TBP连接的链霉亲和素的5％BSA中在室温下封闭膜1小时。继续如上所述的Western印迹注意：对于50ng底物，使用1:5000稀释的VU-1抗体检测泛素和1：150,000稀释的Prk8抗体检测Parkin。在生物素化的泛素的情况下，使用稀释度为1:100,000的链霉亲和素-HRP。对于其他量，应相应地调整抗体的稀释。对于稀释度> 1:50000，推荐预稀释（例如稀释抗体1:100，然后1:1000稀释）。如果加入叠氮化钠，可以在4℃储存预稀释液。然而，叠氮化钠将抑制HRP，因此不推荐用于链霉亲和素-HRP。

数据分析

这里描述的方法使用蛋白质印迹分析作为读出。可以使用开放源软件（例如ImageJ或ImageStudio Lite），使用条带强度的密度计量分析来定量PINK1随时间的磷酸化（图1）。用突变体PINK1 D359A进行的反应用作阴性对照。在磷标记凝胶（图1）上，移动的与非移动的带的比允许计算修饰的和未修饰的底物的比率。应至少进行三次独立实验的结果进行统计分析

图1.使用野生型（WT）或激酶死亡（KD）MBP-TcPINK1的N-末端标记的单体泛素的激酶测定。在14％Tris-甘氨酸磷酸盐上检测到磷酸化泛素（上图）和在具有磷酸特异性泛素抗体（pS65-Ub＃2）的标准16％Tris-甘氨酸凝胶上的标记凝胶（下图）.

食谱

10x激酶缓冲液
注意：请立即准备。
200mM HEPES，pH7.4 100 mM DTT
1 mM EGTA
1 mM ATP
100mM MgCl 2/v/v
6x SDS加样缓冲液
注意：存储在-20°C。
375mM Tris，pH 6.8
9％（w/v）SDS
50％（v/v）甘油 9％（v/v）β-巯基乙醇 0.03％（w/v）溴酚蓝
SDS运行缓冲区
注意：存储在RT。
25 mM Tris
200mM甘氨酸 0.1％（w/v）SDS
印迹缓冲区
注意：存储在4°C。
25 mM Tris 192 mM甘氨酸 0.1％（w/v）SDS
20％（v/v）甲醇
TBST
注意：存储在RT。
50mM Tris，pH7.4 150mM NaCl 0.1％（v/v）Tween-20
解决凝胶缓冲液
注意：存储在4°C。
1.5M Tris-Cl，pH 8.8
0.4％（v/v）SDS
14％分离的磷标记凝胶（一种微型凝胶的配方）
注意：请立即准备。
2.75ml分离胶缓冲液
3.875ml AA：Bis 19:1，溶液40％（w/v） 4.103ml水
111μl5mM phos-tag（终浓度：50μM） 111μl10mM ZnCl 2（终浓度：100μM）
110μl10％（w/v）过硫酸铵水溶液
11μlTEMED
8％分离的磷标记凝胶（一种微型凝胶的配方）
注意：请立即准备。
2.75ml分离胶缓冲液
2.214ml AA：Bis 19:1，溶液40％（w/v） 5.764毫升MQ水
111μl5mM phos-tag（终浓度：50μM） 111μl10mM ZnCl 2（终浓度：100μM）
110μl10％（w/v）过硫酸铵的MQ水溶液
11μlTEMED
堆叠凝胶缓冲液
注意：存储在4°C。
0.5 M Tris-Cl，pH 6.8
0.4％（w/v）SDS
堆叠胶（两个迷你凝胶的配方）
注意：请立即准备。
2.06ml堆积凝胶缓冲液
930μlAA：Bis 19:1，溶液40％（w/v） 5.17毫升MQ水
83μl10％（w/v）过硫酸铵的MQ水溶液
8μlTEMED
Phos标记凝胶洗涤缓冲液1
注意：请立即准备或储存。
1×印迹缓冲液
0.01％（w/v）SDS
1mM EDTA，pH8.0
Phos标记凝胶洗涤缓冲液2
注意：请立即准备或储存。
1×印迹缓冲液
0.01％（w/v）SDS
抗原回收溶液
注意：从25％（v/v）戊二醛溶液中新鲜制备或室温储存。
PBS
0.5％（v/v）戊二醛
磷酸盐缓冲液（PBS）
注意：存储在RT。
137.93mM NaCl 2.67mM KCl
8.06mM Na 2 HPO 4
1.47mM KH 2 PO 4 sub/

致谢

该协议改编自Fiesel等人。（2015）和Fiesel和Springer（2015）。 FCF是美国帕金森病协会研究金的接受者。 WS的部分支持由NIH/NINDS R01NS085070，迈克尔·福克斯帕金森研究基金会，线粒体医学基金会，梅奥诊所基金会，个体化医学中心，再生医学中心，生物医学发现中心，万豪家庭基金会和Gerstner家庭职业发展奖。 WS是佛罗里达州梅奥诊所的神经科学聚焦研究团队的成员。

参考文献

Fiesel，FC和Springer，W.（2015）。磷酸化泛素（p-S65-Ub）的疾病相关性。自噬 11（11）：2125-2126。
Firesel，FC，Ando，M.，Hudec，R.，Hill，AR，Castanedes-Casey，M.，Caulfield，TR，Moussaud-Lamodiere，EL，Stankowski，JN，Bauer，PO，Lorenzo-Betancor， Ferrer，I.，Arbelo，JM，Siuda，J.，Chen，L.，Dawson，VL，Dawson，TM，Wszolek，ZK，Ross，OA，Dickson，DWand Springer，W。（2015） PINK1依赖性泛素磷酸化的生理相关性的影响。在一些实施方案中，PINK1依赖性泛素磷酸化与PTEN1依赖性泛素磷酸化有关。 a> EMBO Rep 16（9）：1114-1130。