材料和试剂

滤纸，55mm（Sigma-Aldrich，Whatman ，目录号：WHA1441055）
Millicell器官型滤器插件0.4μm，30mm（EDM Millipore，目录号：Picmorg50）
6孔培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：140675）
24孔组织学托盘（Sigma-Aldrich，CELLSTAR ，目录号：662160）
50mm灭菌培养皿（Camlab，目录号：p17118）注意：此链接会导致一系列培养皿。
移液管吸头，1,000μl（SARSTEDT，目录号：70.762.010）
移液管吸头，200μl（SARSTEDT，目录号：70.760.012）
注射器
玻璃显微镜载玻片（Academy Science，目录号：N/A143）
玻璃盖玻片（VWR，目录号：631-0133）
锡箔
小鼠（8-20天龄）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：32221）
丙酮（Alfa Aesar，目录号：L10407）
戊巴比妥钠（Pentoject）（Animalcare，目录号：XVD-132）
（Edu）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：A10044）的5'-乙炔基-2'-脱氧尿苷
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
磷酸盐缓冲盐水（Dulbecco A）（PBS）（Oxoid Limited，目录号：BR0014）
Triton X-100（VWR，目录号：28817.295）
硫酸铜五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（VWR，目录号：84845.230）
生物素 - 叠氮化物（Kerafast，目录号：EVU101）
抗坏血酸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12950364）
链霉亲和素Alexa 555 缀合物（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：S-32355）
Vectashield封固剂（Vecta Laboratories，目录号：H-1000和H-1200）
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）
指甲油
抗PKD2L-1（多囊肾病2样1蛋白）
PBS平板电脑
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 H 2·H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10667823）
磷酸氢二钠无水（Na 2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10396313）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
盐酸三甲胺（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
蔗糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10386100）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：31437）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：746436）
硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（VWR，目录号：25165.260）
葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10539380）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：21114）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D6546）
青霉素和链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4458）
Neurobasal A培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10888-022）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
B-27补充物（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17504-044）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F6178）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
0.2 M磷酸盐缓冲液（PB）（参见配方）
0.1 M Tris缓冲液（见配方）
蔗糖人工脑脊液（见配方）
8％多聚甲醛溶液（PFA）（参见配方）
4％多聚甲醛在0.1M PB中的溶液（参见配方）
解剖介质（见配方）
含血清培养基（见配方）
培养基无血清（见配方）

设备

高压灭菌器（Dixons Surgical Instrument，型号：VARIO 1528）
P1000移液管经典移液管（Gilson Scientific，目录号：F123602）
P20移液管经典移液管（Gilson Scientific，目录号：F123600）
层流罩（生物安全柜）（贝克公司，型号：Steril Gard II类A型）
CO 2培养箱（Panasonic，型号：MCO-18AC-PE）
解剖显微镜（Vickers，instrument）
解剖设备（图1）

解剖剪刀
弹簧剪刀
精细镊子x 2
微风

组织切碎机（McIlwain）
剃刀刀片（Wilkinson剑）
振动板（IKA，型号：Vibrax-vxr）
精彩画笔

图1.用于解剖的设备

程序

器官切片的制备
1. 高压灭菌夹层设备，滤纸和Gilson移液器的提示
2. 在层流罩中准备解剖介质和培养基
3. 将预适应培养基在培养箱中37℃培养
4. 用70％乙醇擦拭组织切碎器，并固定新鲜的剃刀刀片到位，首先用丙酮擦拭，以去除任何油脂，然后用70％乙醇擦拭。
5. 补充新鲜蔗糖人工脑脊液
6. 终末麻醉小鼠，通过腹膜内注射戊巴比妥钠（60mg/kg）在8-20天之间老化。当所有的脚踝退缩反射已经停止并且对后肢的强烈的掐捏没有反应，也没有角膜反射时，认为该动物对于该过程被充分麻醉。
7. 打开胸部，切除肋骨，露出心脏。然后通过左心室用25ml冰冷的蔗糖人工脑脊液进行经心脏灌注，以增强切片的活力。这由Gage等人说明。（2012）。
  注意：此程序使用固定剂进行，对于该方案，蔗糖人工脑脊液通过注射器给药 - 不需要泵系统。
8. 去除背部皮肤，进行背椎间盘切除术暴露脊髓。删除脊髓使用细弹簧剪刀和细镊子，并放置在含有冰冷的解剖介质的50毫米培养皿（图2）。这个过程在取自Gunther等人的视频中示出。（2012）。
  注意：在本例中，程序在固定组织上进行。对于器官切片培养物，脊髓在解剖自由但在冷剥离介质中后，不能放置在多聚甲醛溶液中。
  
  图2.描绘脊髓切开的一系列图像
9. 在解剖显微镜下，使用细镊子除去脑膜（脑，蛛网膜和硬脑膜）。选择脊髓的中下胸部/上腰部（大约T8-L2;图3）。
  
  图3.从脊髓中取出小叶。 A.显示脑膜的图表（摘自2016年5月访问的"医学词典"）; B.描绘去除脑膜的图像; C.显示选择用于培养的区域的图。
10. 使用微滴管将选定的脊髓区域转移到用位于组织切碎器的板上的切割介质润湿的无菌滤纸上，并切割300μm的横切片。
11. 转移切片，使用小刮刀，到含有冰冷的解剖介质的培养皿，这将删除任何兴奋性毒性化学品和碎片。
12. 在使用细镊子和小刮刀的解剖显微镜下，分离切片并丢弃任何损伤的切片注意：从这一点开始的所有程序都在层流罩中进行。
13. 吸取1毫升预驯化培养基到无菌6孔培养板的每个孔，并使用无菌钳，在培养基的顶部放置millicell器官型滤器插入。
14. 紧接着，使用具有无菌末端的Gilson P1000移液管，其末端被切除以加宽直径（从而限制对切片的损伤），将2至6个切片转移到每个过滤器上。必须注意，切片不彼此接触或过滤器的侧面。用无菌尖端的Gilson移液管从切片周围除去所有多余的培养基;确保过滤器上方没有介质（图4）。
  
  图4.制备器官切片培养的方法
15. 转移培养板到孵化器，其中切片在标准条件下保持在37°C; 100％湿度，95％空气，5％CO 2富集环境
16. 培养24小时后，使用无菌镊子将器官型滤器小心地从孔中取出，使用Gilson P1000移液管用无菌尖取出培养基，并使用Gi??lson P1000移液管用1ml无血清培养基替换培养基无菌尖端。小心地将过滤器放回新鲜介质，确保过滤器下没有气泡。最初需要血清，因为它帮助切片从外植创伤中恢复。改变为无血清培养基的关键优点是可以确定确切的成分。血清还可以包含影响特定细胞群生长的物质，并且可以促进小胶质细胞增殖（Coltman和Ide，1996）。
17. 对于培养中的剩余时间，取出一半培养基（0.5ml），并每隔一天更换0.5ml新鲜无血清培养基。这种技术留下一些天然生长因子，这有助于在培养的切片中维持良好的活力。培养的切片保持良好的形态（图5）。
  
  图5.在培养物中生长的器官性脊髓切片
向器官型培养物中加入5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）
1. 培养48小时后，加入1μl的EdU（1mM）直接到每个孔的1ml培养基中。在任何后续培养基更换后加入新鲜EdU（0.5μl）。 EdU是胸苷类似物，其在细胞周期的S期中的活性合成期间并入DNA中（图6）（Chehrehasa等人，2009），提供了快速和可重复的方法，用于研究细胞增殖（图7）注意：如果您不想调查细胞增殖，可以省略此阶段。
  
  图6.将EdU并入新合成的DNA中，并添加点击化学和荧光叠氮化物进行可视化
  
  图7.培养切片的时间线。培养切片和添加EdU的时间示意图。
2. 在培养物中分配的时间后，通过从6孔培养板中原位取出滤膜来固定切片并置于1ml的4％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液一个新的6孔培养板。小心地在过滤器的顶部应用另外500μl的4％多聚甲醛溶液，完全覆盖切片
3. 在4℃下将切片在固定液中保持6小时
4. 使用精细的油漆刷，小心地将切片从过滤器中取出，并单独放置在24孔组织学托盘中的500μl0.1 M磷酸盐缓冲盐水中。
  注意：切片可以在4°C下储存在磷酸盐缓冲液中，最多7天。
器官型培养中的EdU检测
切片保持在24孔组织学托盘中，并且在手术期间继续这种自由浮动切片的技术。在分配时间结束时使用移液管小心地从孔中移出每种溶液，并且通过允许其沿着孔的侧面跑下而不直接在精细切片的顶部上而小心地添加下一个溶液。除非另有说明，所有步骤在室温下进行，在振动板上轻轻搅拌各部分
1. 在含有0.2％triton的500μlPBS中孵育12分钟
2. 在500μl0.1M Tris缓冲液中洗涤2×10分钟。
3. 在每个孔中混合320μl蒸馏水，25μlTris缓冲液（2M），50μl硫酸铜（10mM），5μl生物素化叠氮化物（1mM）和100μl抗坏血酸（0.5M）的混合物中孵育切片每次补充新鲜）30分钟。
4. 在500μl0.1M Tris缓冲液中洗涤2×10分钟
5. 在500μlPBS中洗涤1×10分钟
6. 在500μl含有0.1％triton的PBS中的链霉抗生物素蛋白Alexa 555 1：1,000中孵育1小时，通过将组织学托盘包裹在锡箔中以避免光照，以及随后的步骤。
7. 在500μlPBS中洗涤3×10分钟。
8. 然后可以根据供应商在安装之前的这个阶段的说明用合适的抗体对切片进行免疫组织化学标记（图8）。
  注意：在第一抗体中，切片不搅拌超过2小时，因为它们开始崩解。如果需要更长的孵育时间，在组织学托盘中在4℃不搅拌。
9. 自由漂浮在培养皿中的蒸馏水的切片，并小心地将切片漂浮在玻璃载片上，并用一个精细的油漆刷引导到位。
10. 避光保存，让空气干燥。
11. 使用带或不带DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）的VectaShield封固介质进行安装。
12. 应用玻璃盖片和用指甲油密封。

代表数据

在检测EdU后，这些切片也用标记脑脊髓接触神经元的抗PKD2L-1（多囊肾病2样1蛋白）免疫组织化学标记。

图8.在围绕器官型培养的脊髓切片的中央管的区域中的EdU标记的实例</strong>

笔记

最小化脊髓从动物中移除并在培养物中建立所花费的时间对于在切片中获得良好的活力是必需的。因此，必须尽可能有效地进行制备，同时仍然确保脊髓没有损伤。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将10个PBS片剂溶解在1L蒸馏水（pH7.4）中
0.2 M磷酸盐缓冲液（PB）
将9.35g NaH 2 PO 4·2H 2·2H 2溶于300ml蒸馏水中。
在1,200ml蒸馏水中溶解33.85g Na 2 HPO 4。
将NaH 2 PO 4 4·2H 2 O溶液加入到Na 2 HPO 4水溶液中，溶液，直至pH为7.4。
0.1 M Tris缓冲液
0.695克Trizma碱
3.03g盐酸三甲胺 500毫升蒸馏水
注意：如有必要，用几滴氢氧化钠调节至pH 7.6。
蔗糖人工脑脊液
74.5克蔗糖 2.184g NaHCO 3·
0.2237克KCl
0.4933g MgSO 4 7H 2 O 2·h/v 0.39g NaH 2 PO 4 sub/
1升蒸馏水
注意：将除了CaCl 2 2以外的所有成分添加到蒸馏水中，摇动以完全溶解，然后在末端加入CaCl 2并摇动分散。
8％多聚甲醛溶液（PFA） 80g多聚甲醛
1升蒸馏水
注意：可能需要温和加热和连续搅拌以帮助溶解多聚甲醛;这必须在通风橱中进行。溶液变浑浊，用几滴1M氢氧化钠溶液澄清，如有必要，用少量稀HCl调节pH至7.2。
4％多聚甲醛在0.1M PB中的溶液 50 ml 8％PFA
50ml 0.2M PB
解剖介质
Dulbecco's modified Eagles培养基
青霉素和链霉素的100倍稀释液（母液：5,000单位青霉素，5mg链霉素）
含血清培养基
Neurobasal A介质
100倍稀释的L-谷氨酰胺（储备溶液：200mM）青霉素和链霉素的100倍稀释液（母液：5,000单位青霉素，5mg链霉素）
胎牛血清稀释10倍
培养基无血清
Neurobasal A介质
稀释50倍B27补充剂
100倍稀释的L-谷氨酰胺（储备溶液：200mM）青霉素和链霉素的100倍稀释液（母液：5,000单位青霉素，5mg链霉素）

致谢

这种被称为界面方法的方法被修改为用于脊髓培养从Stoppini等人的原始方法。（1991）。

参考文献

Chehrehasa，F.，Meedeniya，AC，Dwyer，P.，Abrahamsen，G.和Mackay-Sim，A。（2009）。 EdU，一种用于在神经系统中标记增殖细胞的新的胸腺嘧啶类似物。 J Neurosci Methods ：122-130。

Coltman，BW和Ide，CF（1996）。 Temporal表征海马器官型切片培养物的齿状回中的小胶质细胞，IL-1β样免疫反应性和星形胶质细胞。 Int J Dev Neurosci 14（6）：707-719。

Gage，GJ，Kipke，DR和Shain，W。（2012）。对于啮齿动物的全动物灌注固定。（65）。

Gunther，R.，Suhr，M.，Koch，JC，Bahr，M.，Lingor，P。和Tonges，L.（2012）。用于肌萎缩性侧索硬化（ALS）的小鼠模型中的临床测试和脊髓切除术 em>（61）。

Stoppini，L.，Buchs，PA和Muller，D。（1991）。用于神经组织的器官培养的简单方法。 J Neurosci Methods 37（2）：173-182。