材料和试剂

6孔皿（Corning，Falcon ，目录号：353046）（在室温下贮存）
PVDF膜（GE Healthcare，目录号：10600023）（在室温下保存）
DT40细胞系（DT40是来源于白喉毒鸡中的禽白血病病毒诱导的淋巴管淋巴瘤的B细胞系）（ATCC，目录号：CRL-2111）（胞质PNGase的内源性表达）
智人结肠结肠直肠癌细胞系（HCT116）（ATCC，目录号：CCL-247），HCT116细胞（ATCC，目录号：CCL-247）（胞质PNGase的内源性表达）
Opti-mem（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985-070）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：11668019）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（NACALAI TESQUE，目录号：08458-45）（在4℃保存）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270-106）
100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（NACALAI TESQUE）（-20℃保存）
RPMI（NACALAI TESQUE，目录号：30263-95）（在4℃贮存）
鸡血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：16110-082）
将1M二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-08976）（用于还原蛋白质;在水中;储存在-20℃下）
20mM苄氧羰基 - 缬氨酰 - 丙氨酰 - 天冬氨酰基 - [O-甲基] - 氟甲基酮（Z-VAD-fmk）（Promega，目录号：G7231）（用于抑制PNGase活性;贮存在-20℃）
Nonidet P-40（NACALAI TESQUE，目录号：23640-94）（对于HCT116;在室温下储存）
4％洋地黄皂苷（Wako Pure Chemical Industries，目录号：043-21371）（对于DT40;在水中;储存在-80℃）
抗myc抗体（医疗和生物实验室，目录号：562）（-20℃保存）
与HRP偶联的抗β-肌动蛋白抗体（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-24573）
NaCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
Na HPO ₄
KCl
KH ₂ PO ₄
Tris/HCl，pH8.0（Sigma-Aldrich，目录号：T6791）（在室温下贮存）
甘油
溴酚蓝（BPB）
十二烷基硫酸钠
蛋白酶抑制剂混合物（100x）（NACALAI TESQUE，目录号：25955-11）（用于抑制各种蛋白酶活性;在ddH 2 O中;储存在-20℃）
10mM Z-Leu-Leu-Leu-CHO（MG132）（PEPTIDE INSTITUTE，目录号：3175-v）（用于抑制蛋白酶体活性;在DMSO中;储存在-20℃）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
2x十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（pH 6.8）（参见配方）
缓冲液A（储存在4°C）（参见配方）
缓冲液B（参见配方）

设备

高速冷藏微量离心机（Tomy，型号：MX-301）
mPAGE（ATTO，型号：AE-6530）（使用手工制备的10％凝胶）
传输设备（ATTO，型号：WSE-4020）
加热块（TAITEC，型号：DTU-1BN）
微孔器（Digital Bio，型号：MP-100）

软件

ImageJ

程序

在37℃，潮湿的5％CO 2中，将补充有10％胎牛血清和抗生素（100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）的Dulbecco改良的Eagle培养基（葡萄糖4.5g/L）中的贴壁HCT116细胞培养> 2/95％空气气氛。培养物在补充有10％胎牛血清，1％鸡血清的RPMI1640培养基中以1×10 5 -1×10 6个细胞/ml的密度悬浮DT40细胞，抗生素（100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）在39.5℃下在潮湿的5％CO 2/95％空气气氛中培养。
使用1μg质粒DNA，300μlOpti-mem和10μlLipofectamine 2000（Invitrogen），转染8.0×10 5个HCT116细胞（在6孔板中40-60％汇合）根据厂家说明（转染后培养基不更换）。为了获得1.05×10 7个细胞转染的细胞，用8μg质粒DNA电穿孔3次3.5×10 6个DT40细胞，两次脉冲1500V，15msec，根据制造商的说明
在转染后收集约2.0×10 6个HCT116细胞或4.0×10 6个DT40细胞用于进一步分析24小时（HCT116细胞）或16小时（DT40细胞）。为此，用1ml PBS洗涤细胞三次，刮去，在4℃下以800×g离心2分钟。在该步骤之后，以相同的方式处理来自HCT116细胞和DT40细胞的样品
取出样品的上清液，将细胞沉淀悬浮在200μl缓冲液A中，并在冰上孵育20分钟以裂解细胞。
注意：缓冲区A不能包含Z-VAD-fmk，因为它会抑制PNGase活动。
通过在4℃下以17,800×g离心10分钟澄清细胞裂解物，并将上清液转移到新管中。废弃颗粒。
为了允许PNGase加工错误折叠的蛋白质，将细胞裂解物在冰上进一步孵育不同时间（良好的起始范围为4小时）。在不同时间取出40-50微升等分试样，立即与40-50微升缓冲液B混合，补充100 mM DTT（用于还原）和2μMZ-VAD-fmk（抑制PNG酶），并在100°C孵育5分钟。通过SDS-PAGE分离10μl样品，然后使用PVDF膜进行免疫印迹，并用针对目标蛋白的抗体进行探测。 SDS-PAGE的百分比取决于目标蛋白质的分子量。可以通过ImageJ或类似程序（图1）分析和比较谱带强度

图1.严重错折叠突变体对内源PNGase更敏感。A.先前描述了鸡EDEM1/2/3三KO细胞（gEDEM TKO）（Ninagawa等人）。，2015）。将指示的myc标记的hATF6α（C）变体（在印迹的左侧指示）在gEDEM-TKO细胞中瞬时表达，并进行PNGase敏感性测定。在指定的时间点后，停止PNGase反应并通过12％SDS-PAGE分析样品，然后用针对myc标签的抗体进行免疫印迹分析。所示数据表示两个重复中的单个代表性实验。较少折叠的蛋白质对PNG酶更敏感，因此在hATF6α（C）-myct突变体，Δ111-119,182-194突变体和Δ219-270突变体中的较早时间点检测到部分去糖基化条带。见Ninagawa 。（2015）进一步的蛋白质信息。 B.该图显示（A）的上带/总带的％强度。通过imageJ分析条带强度。

笔记

包括HCT116细胞，DT40细胞和小鼠胚胎成纤维细胞在内的大多数细胞内源表达PNGase。因此，不需要外源表达PNGase。其他细胞类型必须测试PNGase表达。 PNGase也在酵母中表达，但我们尚未检查该测定是否适用于酵母细胞
该测定已经用于测定几种蛋白质的折叠状态，然而，一些糖蛋白对PNG酶完全不敏感。
使用强洗涤剂例如SDS不适合于该方法，因为PNGase活性可能丧失。在我们的例子中，我们对哺乳动物细胞使用1％NP-40，对于鸡细胞使用1％洋地黄皂苷。但你可以使用1％NP-40鸡细胞和1％毛地黄皂苷的哺乳动物细胞。不太强的洗涤剂可用于PNGase测定。
作为对照，可以包括两微摩尔的PNG酶抑制剂Z-vad-fmk。
您可以通过蛋白质浓度或细胞数量使样品标准化。或者您可以使用与HRP结合的抗β-肌动蛋白抗体进行SDS-PAGE以显示蛋白质的等量。
我们可以提供质粒来表达用于阳性对照（折叠）的hATF6α（C）-myct 1-302和Δ280-298，以及用于阴性对照（折叠较少）的Δ111-119,182-194和Δ219-270。
该测定法已用于外源表达的蛋白质，但也应适用于内源性蛋白质
我们建议，当你分析糖蛋白，你应该包括Z-VAD-fmk在裂解缓冲液中，以抑制PNGase活性细胞裂解后。
重组PNG酶也可用于PNGase敏感性测定（Liu等人，2016）。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl 8.1mM Na 2 HPO 4
2.68mM KCl
1.47mM KH 2 PO 4 sub/
2x十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（pH 6.8） 100mM Tris/HCl（pH6.8）
20％甘油 0.2％溴酚蓝（BPB）
4％十二烷基硫酸钠
缓冲区A
50mM Tris/HCl（pH8.0） 1％NP-40或1％洋地黄皂苷
150mM NaCl 蛋白酶抑制剂混合物（使用前加入）
20μMMG132（使用前添加）
储存在4°C
注意：1％NP-40用于哺乳动物细胞如HCT116细胞，1％洋地黄皂苷用于鸡细胞如DT40细胞。
缓冲区B
1x SDS样品缓冲液（室温保存）
100 mM二硫苏糖醇（使用前加入）
2μMZ-VAD-fmk（使用前添加）

致谢

该协议改编自Ninagawa等人使用。（2015）。

参考文献

Liu，Y. C，Fujimori，DG和Weissman，JS（2016）。 Htm1p-Pdi1p是折叠敏感性甘露糖苷酶，其标记用于ER相关蛋白降解的N-糖蛋白。美国国家科学院院刊。 113（28）：E4015-4024。

Ninagawa，S.，Okada，T.，Sumitomo，Y.，Horimoto，S.，Sugimoto，T.，Ishikawa，T.，Takeda，S.，Yamamoto，T.，Suzuki，T.，Kamiya， Kato，K. and Mori，K.（2015）。