材料和试剂

6孔皿（Corning，Falcon ，目录号：353046）
PVDF膜（GE Healthcare，目录号：10600023）
DT40细胞系（DT40是来源于白喉毒鸡中的禽白血病病毒诱导的淋巴管淋巴瘤的B细胞系）（ATCC，目录号：CRL-2111）
智人结肠结肠直肠癌细胞系（HCT116）（ATCC，目录号：CCL-247）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（NACALAI TESQUE，目录号：08458-45）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270-106）
100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（NACALAI TESQUE）
RPMI（NACALAI TESQUE，目录号：30263-95）
鸡血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：16110-082）
Opti-mem（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985-070）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：11668019）
2.5g/L胰蛋白酶（NACALAI TESQUE，目录号：32777-44）
蛋白酶抑制剂混合物（100x）（NACALAI TESQUE，目录号：25955-11）（用于抑制各种蛋白酶活性，例如在ddH 2 O中的胰蛋白酶;储存在-20℃） />
NaCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）（用于DT40）
Na HPO ₄
KCl
KH ₂ PO ₄
Tris/HCl（pH8.0）（Sigma-Aldrich，目录号：T6791）（在室温下保存）
甘油
溴酚蓝（BPB）
十二烷基硫酸钠
Nonidet P-40（NACALAI TESQUE，目录号：23640-94）（用于HCT116）
20mM苄氧羰基 - 缬氨酰 - 丙氨酰 - 天冬氨酰基 - [O-甲基] - 氟甲基酮（Z-VAD-fmk）（Promega，目录号：G7231）（用于抑制PNGase活性）
10mM Z-Leu-Leu-Leu-CHO（MG132）（PEPTIDE INSTITUTE，目录号：3175-v）（DMSO中;抑制蛋白酶体活性，-20℃贮存）
将1M二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-08976）（在水中;用于蛋白质还原）
抗β-肌动蛋白抗体（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-24573）
抗myc抗体（MEDICAL& BIOLOGICAL LABORATORIES，目录号：562）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
2x十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（pH 6.8）（参见配方）
缓冲区A（参见配方）
缓冲液B（参见配方）

设备

高速冷藏微量离心机（Tomy，型号：MX-301）
mPAGE（ATTO，型号：AE-6530）（使用手工制备的10％凝胶）
传输设备（ATTO，型号：WSE-4020）
加热块（TAITEC，型号：DTU-1BN）
微孔器（Digital Bio，型号：MP-100）

软件

ImageJ

程序

在37℃，潮湿的5％CO 2中，将补充有10％胎牛血清和抗生素（100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）的Dulbecco改良的Eagle培养基（葡萄糖4.5g/L）中的贴壁HCT116细胞培养> 2/95％空气气氛。培养物在补充有10％胎牛血清，1％鸡血清的RPMI1640培养基中以1×10 5 -1×10 6个细胞/ml的密度悬浮DT40细胞，抗生素（100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素）中在39.5℃下在潮湿的5％CO 2/95％空气气氛中培养。
使用1μg质粒DNA，300μlOpti-mem和10μlLipofectamine 2000（Invitrogen），转染8.0×10 5个HCT116细胞（在6孔板中40-60％汇合）根据厂家说明（转染后培养基不更换）。为了获得1.05×10 7个细胞转染的细胞，用8μg质粒DNA电穿孔3次3.5×10 6个DT40细胞，两次脉冲1500V，15msec，根据制造商的说明
在转染后收集约2.0×10 6个HCT116细胞或4.0×10 6个DT40细胞用于进一步分析24小时（HCT116细胞）或16小时（DT40细胞）。为此，用1ml PBS洗涤细胞三次，刮下并在4℃以3,000xg离心2分钟。弃去样品的上清液，悬浮细胞沉淀在400微升（对于HCT116细胞）或250微升（对于DT40细胞）缓冲液A中，在冰上孵育20分钟以裂解细胞。我们使用较小量的缓冲液A用于DT40细胞，因为DT40细胞不含有与HCT116细胞一样多的蛋白质。在该步骤之后，以相同的方式处理来自HCT116细胞和DT40细胞的样品注意：重要的是，缓冲液A不能含有蛋白酶抑制剂混合物，因为它会抑制胰蛋白酶活性。
通过在4℃下以17,800×g离心10分钟澄清细胞裂解物，并将上清液转移到新管中。弃去颗粒。
为了允许胰蛋白酶处理错误折叠的蛋白质，用1μl胰蛋白酶溶液（测试不同浓度从1μg/ml至100μg/ml）将50μl等分试样（在蛋白质浓度为1mg/ml的情况下）孵育15分钟min。为了停止胰蛋白酶反应，将样品与40-50μl补充有10x蛋白酶抑制剂混合物（我们通常使用高抑制剂浓度：5x最终）的缓冲液B混合，并在100℃孵育5分钟。重要的是，每3分钟4个样品可以处理与胰蛋白酶相等的孵育时间
通过SDS-PAGE分离10μl样品（约5μg），然后使用PVDF膜进行免疫印迹，并用针对目的蛋白的抗体进行探测。 SDS-PAGE的百分比取决于目标蛋白质的分子量。可以通过ImageJ或类似程序（图1）分析和比较谱带强度

图1.严重错折叠突变体对胰蛋白酶更敏感。A.先前描述了鸡EDEM1/2/3三重KO细胞（gEDEM TKO）（Ninagawa等人， 2015）。指示的myc标记的hATF6α（C）变体在gEDEM-TKO细胞中瞬时表达，并进行胰蛋白酶敏感性测定。在指定的时间点后，停止胰蛋白酶反应并通过12％SDS-PAGE分析样品，然后用针对myc标签的抗体进行免疫印迹。所示数据代表三个重复中的单个代表性实验。较少折叠的蛋白质对胰蛋白酶更敏感，因此hATF6α（C）-myct突变体Δ111-119,182-194突变体和Δ219-270突变体被较低的胰蛋白酶浓度切割。 B.通过ImageJ显示（A）中的条带强度的定量并计算剩余蛋白质的百分比。 C.等量装载细胞裂解物，通过裂解物的免疫印迹显示并用抗β-肌动蛋白的抗体探测。

笔记

与胰蛋白酶的孵育时间和胰蛋白酶的浓度应针对感兴趣的蛋白质进行优化。
胰蛋白酶的批次和新鲜度可以影响结果并且可以改变独立实验之间的结果（我们使用在4℃下储存的胰蛋白酶）。无论如何，你可以比较蛋白质之间的折叠的紧张感兴趣。
在PBS中稀释胰蛋白酶以获得预期浓度
我们使用gEDEM TKO细胞。该方法适用于多种细胞系和重组蛋白。
该方法可应用于重组蛋白。在这种情况下，您可能会降低胰蛋白酶的浓度。
CPY和CPY *（Izawa等人，2012），以及GFP和GFP变体（Xu等人，2013）是本测定中使用的其他实例。我们可以提供质粒来表达用于阳性对照（折叠）的hATF6α（C）-myct 1-302和Δ280-298，以及用于阴性对照（折叠较少）的Δ111-119,182-194和Δ219-270。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl 8.1mM Na 2 HPO 4
2.68mM KCl
1.47mM KH 2 PO 4 sub/
2x十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（pH 6.8） 100mM Tris/HCl（pH6.8）
20％甘油 0.2％溴酚蓝（BPB）
4％十二烷基硫酸钠
缓冲区A
50mM Tris/HCl（pH8.0） 1％NP-40
150mM NaCl 2μMZ-VAD-fmk（使用前添加）
20μMMG132（使用前添加）
储存在4°C。
缓冲区B
1x SDS样品缓冲液
100 mM二硫苏糖醇（使用前加入）
10x蛋白酶抑制剂混合物（使用前加入，从原始蛋白酶抑制剂混合物稀释10倍）室温保存。

致谢

该协议改编自Ninagawa等人（2015），Izawa等人（2012）和Xu等人的。（2013年）。

参考文献

Izawa，T.，Nagai，H.，Endo，T.and Nishikawa，S.（2012）。 Yos9p和Hrd1p介导错误折叠的蛋白质对ER相关降解的ER保留。 Mol Biol Cell 23（7）：1283-1293。
Ninagawa，S.，Okada，T.，Sumitomo，Y.，Horimoto，S.，Sugimoto，T.，Ishikawa，T.，Takeda，S.，Yamamoto，T.，Suzuki，T.，Kamiya， Kato，K. and Mori，K.（2015）。通过非糖蛋白ERAD途径强制破坏严重错误折叠的哺乳动物糖蛋白。细胞生物学211（4）：775-784。
Xu，C.，Wang，S.，Thibault，G.and Ng，DT（2013）。