材料和试剂

90 mm塑料培养皿
50ml管
1.5毫升管
展叶剑叶藓质子细胞（培养4天）
BCDAT培养基（Nishiyama等人，2000）
甲磺酸甲酯（MMS）（Sigma-Aldrich，目录号：129925）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：V800117）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：09-0770）
RNase A
LA Taq（TAKARA BIO，目录号：RR002A）
琼脂糖粉末（Promega，目录号：V3125）
0.7％琼脂糖凝胶
溴化乙锭（EtBr）
Power SYBR 绿色PCR主混合物（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，目录号：4367659）
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（Sigma-Aldrich，目录号：H-5882）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：28-2270）
Tris-HCl，pH8.0（Wako Pure Chemical Industries，目录号：206-07884）
乙二胺-N，N，N'，N'-四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）（DOJINDO，目录号：345-01865）
PEG8000（MP Biomedicals，目录号：02194839）
用于长扩增子定量PCR的寡核苷酸DNA引物：
核DNA（5'-GTGGAAGTGAGATGCAGTTTGG-3'和5'-GTGGCTCTGGACAGTGAAATTG-3'）
叶绿体DNA（5'-AATTGGAGTCGGTCCTTCCATA-3'和5'-TGGCAAATACAATGGCAAAAAG-3'）
线粒体DNA（5'-GACTGCCCTCACTAGGATGCTT-3'和5'-TGGGTGATTTACTCCATTGACG-3'）
用于短扩增子定量PCR的寡核苷酸DNA引物：
核DNA（5'-CAACCGTCTTCTGTGTCTAGGTC-3'和5'-GAAACCGGCCTGCATTACATG-3'）
叶绿体DNA（5'-AGTAATCCCATCGCGTGACAT-3'和5'-AGGTATGGAAAAAATCGCTGAAAA-3'）
线粒体DNA（5'-CGTGCTAAAAATCCAGTCCATTC-3'和5'-AGCAAAGAAGTCAAGACCTAACAAAAC-3'）
2x CTAB缓冲液（参见配方）
10％CTAB（参见配方）
CTAB ppt缓冲区（参见配方）
NaCl-TE（参见配方）
TE缓冲区（参见配方）
PEG溶液（参见配方）

设备

镊子
多珠冲击器（Yasui Kikai）
真空泵（Tokyo Rikakikai，目录号：AS-3）
台式离心机用于1.5 ml管
用于1.5ml管（TAITEC，目录号：DTU-2CN）的加热块
标准热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-8720JA）
实时PCR热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ，型号：Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systems）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/）
Excel（Microsoft）

程序

MMS处理植物
1. 培养 p。 patens 质粒细胞在四个BCDAT琼脂平板上，在25℃连续光照下。
2. Immerse P。 patens质粒细胞在含有20mM MMS的12ml BCDAT液体培养基中在90mm塑料培养皿中真空培养1小时。注意，在MMS处理之前收获未受损的对照样品。这些应包括三个生物学重复注意：MMS是致癌物质。
3. 用BCDAT液体培养基（50ml试管中用15ml BCDAT液体培养基洗两次）洗涤后，在25℃连续光照下培养质子细胞。
4. 使用镊子，在洗涤后0,6,24和48小时收获细胞
提取总基因组DNA
1. 使用匀浆器（Multi-beads shocker：1,500rpm，10秒，三次）研磨冷冻的质子细胞。或者，可以使用研钵和杵
2. 加入等体积（大约300微升在1.5毫升管）的2×CTAB缓冲液到粉末状的质子细胞。混合，然后在60℃下孵育1小时
3. 与等体积的氯仿混合并在4,500×g离心20分钟。回收水相（约500μl）
4. 加入1/10体积的10％CTAB
5. 用等体积的氯仿提取DNA并回收水相。重复此步骤两次。
6. 加入等体积的CTAB ppt缓冲液，倒转混匀
7. 以4500xg离心20分钟。弃去上清液。
8. 将沉淀溶解在400μlNaCl-TE中。在60℃孵育30分钟。
9. 加入两倍体积的乙醇。
10. 以14,000×g离心10分钟。弃去上清液。
11. 将沉淀溶解在100μlTE中。颗粒在此步骤可能不溶，但在下一步骤中溶解
12. 加入2微升的核糖核酸酶A（1毫克/毫升），并在37℃下孵育1小时
13. 加入等体积的PEG溶液。
14. 在4℃下以14,000×g离心10分钟。
15. 除去上清液后，用70％乙醇冲洗沉淀
16. 将沉淀溶于100μlTE中。
长扩增子定量PCR
进行长扩增子PCR以定量未损伤的DNA模板的量
1. 设计引物以从核，叶绿体和线粒体基因组产生8-10kb PCR扩增子。
  注意：长的扩增子有效地检测DNA损伤;然而，扩增效率很差。
2. 准备一个稀释系列（20，10，5，2.5，1.25和0.625 ng /μl，通过用TE缓冲液稀释）未受损的DNA，跨越受损样品中从最低到最高量的PCR产物的范围，用作标准。通过加入TE缓冲液将样品稀释至10 ng /μl，每次PCR反应使用1μl
3. 使用针对长扩增子（LA-Taq）优化的Taq DNA聚合酶进行2步PCR（第一步，98℃10秒;第二步，68℃10分钟）。将所有样品和对照稀释液进行单个PCR反应。使用所得DNA扩增子以指数方式扩增的PCR循环数。因此，PCR扩增子的所得量/产量反映了反应中使用的DNA模板的量。使用17,20和27个循环分别扩增叶绿体，线粒体和核DNA
4. 在用EtBr染色的0.7％琼脂糖凝胶上电泳以分辨PCR产物（图1）。将适当部分的PCR产物装载在凝胶上
  
  图1.琼脂糖凝胶上的长PCR扩增子的电泳来自核肌动蛋白基因座的长PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的实例。用连续稀释的标准样品分析没有MMS损伤对照（无）和MMS损伤的样品（洗涤后0,6,24和48小时）。 RECA2 -KO作为突变体的例子显示（Odahara等人。，2015）。
短扩增子定量PCR
短扩增子PCR允许核，叶绿体和线粒体DNA的拷贝数量化。标准和实时PCR适用于这种短扩增子定量PCR，但后者提供更准确的值
1. 基于使用插入染料（例如SYBR Green I）的定量实时PCR测定的标准方案，设计引物以扩增约100bp的核，叶绿体和线粒体基因座。
2. 准备稀释系列用作标准对照，包括所有样品浓度。使用在长扩增子PCR中制备的10ng /μl样品DNA是重要的
3. 使用针对实时PCR优化的DNA聚合酶混合物（Power SYBR Green PCR Master Mix）和热循环仪实时PCR系统，使用PCR程序进行实时PCR（第一步，95℃ 15秒;第二步，60℃1分钟）。使用标准样品制备的标准曲线计算每个样品的核，叶绿体和线粒体DNA的相对拷贝数。

数据分析

分析来自MMS损害的恢复

使用"测量"工具用ImageJ测量电泳凝胶中每条带的体积，并通过将它们与使用来自连续稀释的标准样品的那些拟合的标准曲线拟合，计算来自所有样品的长PCR产物的相对量。 />
将长扩增子PCR产物的相对量除以从短扩增PCR产物计算的核，叶绿体和线粒体DNA的相对拷贝数，以获得未损伤DNA的相对拷贝数。
通过将损伤样品中未损伤的DNA的量除以未损伤的对照的未损伤的DNA的量来计算相对恢复。使用 t -test对来自三个生物复制和Excel的数据进行统计分析

食谱

2x CTAB缓冲区
2％CTAB
1.4 M NaCl
100 mM Tris-HCl，pH 8.0
20 mM EDTA
储存在室温（RT）。
10％CTAB
10％CTAB
0.7 M NaCl
存储在RT。
CTAB ppt缓冲区
1％CTAB
50 mM Tris-HCl，pH 8.0
10 mM EDTA
存储在RT。
NaCl-TE
1 M NaCl
10mM Tris-HCl，pH8.0 1mM EDTA
存储在RT。
TE缓冲区
10mM Tris-HCl，pH8.0 1mM EDTA
存储在RT。
PEG溶液
2 M NaCl
20％PEG8000
存储在RT。

致谢

长扩增子PCR测定基于Hunter等人。（2010）略有修改。基因组DNA提取方案基于PHYSCObase（ http://moss.nibb.ac .jp/）。这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部的战略研究基金赠款辅助项目以及下一代世界领先研究人员资助计划（NEXT计划）的支持。

参考文献

Hunter，SE，Jung，D.，Di Giulio，RT和Meyer，JN（2010）。用于分析线粒体DNA损伤，修复和相对拷贝数的QPCR测定法 51（4）：444-451。 >

Nishiyama，T.，Hiwatashi，Y.，Sakakibara，I.，Kato，M.and Hasebe，M。（2000）。通过穿梭诱变在青苔，小立碗藓中标记诱变和基因陷阱。

em> 7（1）：9-17

Odahara，M.，Inouye，T.，Nishimura，Y.和Sekine，Y.（2015）。 RECA在小立碗藓中维持叶绿体基因组稳定性中起双重作用。）：516-526。