材料和试剂

细胞过滤器，无菌（100μm）（Corning，Falcon ，目录号：352360）
10cm标准组织培养皿（Corning，目录号：430293）
50ml锥形管，无菌（Corning，Falcon ，目录号：352070）
一次性手术刀，镊子和剪刀（VWR International）
HER2转基因小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：002376）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（1x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25200-056）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），无菌（自制）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
DMEM/F12-与L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11875-093）
牛血清白蛋白溶液（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）
氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H0888）
IV型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C5138）
透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：H3884）
Pen-Strep（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SV30010）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：93362）
胎牛血清（FBS），热灭活（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30071.03）
胰岛素（用转铁蛋白/硒）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：51500-056）
消化缓冲液（参见配方）
Tris缓冲氯化铵（TAC缓冲液）（参见配方）
完成媒体（见配方）

设备

振荡培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：SHKA5000）
37℃，5％CO 2细胞培养箱（VWR，symphony TM，型号：5.3A）中，
移液器
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5418R）
水浴
血细胞计数器
倒置显微镜（Olympus Corporation，型号：CKX41）
装配有UV光源的组织培养罩（Labconco，型号：Purifier Logic + Class II，A2型生物安全柜）

程序

将实体肿瘤组织处理成单个细胞
1. 使用镊子和剪刀从小鼠乳腺取出肿瘤（图1），并将其放置在10厘米培养皿，倾吐无菌DMEM/F12培养基上保持湿润。
  
  图1. MMTV-HER2小鼠中的自发性乳腺肿瘤
2. 使用手术刀切割肿瘤块，去除坏死组织（如果存在）。坏死组织通常比周围肿瘤更暗更软。
3. 使用一次性手术刀切碎组织直至切碎（图2A和2B），并将切碎的组织转移到50ml锥形小瓶中。
  
  图2.来自自发性肿瘤的肿瘤组织 A.切碎前; B.绞肉后。
4. 加入10ml消化缓冲液（在10ml消化缓冲液中约0.5cm 3）。
5. 用盖子关闭管子，用Parafilm包裹帽子。将管在低至中等速度（例如，100-200rpm）下在37℃摇床中放置1-2小时。
6. 吸取上下消化的组织，并在室温下以530×g离心5分钟以沉淀细胞。
7. 吸出上清液，其中含有脂肪。如果沉淀含有红细胞（在沉淀顶部观察为红色层），将沉淀重悬于5-10ml TAC缓冲液中，并在37℃水浴中孵育3-10分钟。在530×g下在室温下离心5分钟。重复此步骤，直到红细胞不再可见。
8. 将沉淀重悬在10ml DMEM/F12培养基（室温，无补充）中。使用细胞过滤器过滤消化的组织。
  注意：没有必要。通常，我这样做，因为我需要使用它进行FACS或排序。
9. 在530×g下在室温下离心1分钟。将沉淀重悬在10ml DMEM/F12培养基（室温，无补充）中
10. 使用血细胞计数器进行台盼蓝排除试验以确定每ml的活细胞数
11. 种子4-6×10 6个存活细胞进入具有完全培养基的10cm培养皿中。添加1x Pen-Strp。
产生肿瘤细胞系
1. 一旦融合就分裂细胞。通常，细胞在前3次传代中生长非常快。
2. 通过去除成纤维细胞来纯化肿瘤细胞。成纤维细胞通常对胰蛋白酶更敏感，因此可以从板上除去，而肿瘤细胞粘附更长的时间。因此用胰蛋白酶处理细胞（通常在37℃下2-3分钟），并在显微镜下连续监测。一旦成纤维细胞（蓝色箭头）从板上分离，而肿瘤细胞（红色箭头）仍粘附在板上（图3A和3B），轻轻吸入胰蛋白酶并用PBS洗涤。然后胰蛋白酶消化并将肿瘤细胞转移至新平板。重复该步骤几次后，大多数细胞是肿瘤细胞
  
  图3.肿瘤细胞的纯化 A.在胰蛋白酶消化前; B.胰蛋白酶消化后。蓝色箭头：成纤维细胞;红色箭头：肿瘤细胞
3. 3-4代后每5-7天传代一次细胞。在传代过程中，细胞生长缓慢或甚至没有生长。超过90％的细胞死亡。
4. 传代8-9次后，细胞永生化，生长更快更快。图4显示了不同传代的肿瘤细胞的形态
5. 所产生的肿瘤细胞系的形态如图5所示。通过IHC（图6A）和Western（图6B）检测HER2的表达。
6. 通过将细胞接种到HER2转基因小鼠的乳腺脂肪垫中来测试所产生的肿瘤细胞系的致瘤性（图7）。
  
  图4.不同传代时肿瘤细胞的形态学
  
  图5.代表性肿瘤细胞系
  
  图6.肿瘤细胞中的HER2表达。A.肿瘤细胞中HER2的IHC染色（蓝色箭头：成纤维细胞;红色箭头：肿瘤细胞）。 B.在肿瘤细胞系（1：MCF10A-Vector; 2：MCF10A-HER2; 3：代表性细胞系）中的HER2表达。
  
  图7.已建立的肿瘤细胞系的致瘤性。在10天4次/位点接种代表性细胞系4周后，在HER2转基因小鼠中形成肿瘤。

笔记

基于我所做的，可在约30％的肿瘤组织中产生稳定的细胞系。
细胞在传代8-9次或更多次后开始增殖。我认为这是永生化的标志。但是，我不知道底层机制。

食谱

消化缓冲区
DMEM-F/12补充：
10 mM HEPES
2％BSA
0.5μg/ml氢化可的松
1mg/ml IV胶原酶
0.1mg/ml透明质酸酶
1x Pen-Strp
无菌过滤并在4°C下保存
Tris缓冲氯化铵（TAC缓冲液）
0.16 M NH 4 Cl
0.17M Tris
用HCl调节pH至7.65
要制作工作解决方案：
将90ml 0.16M NH 4 Cl和10ml 0.17M Tris混合用HCl
调节至pH 7.2 无菌过滤并在4°C下保存
填写媒体
补充有10％FBS和10μg/ml胰岛素的DMEM-F/12

致谢

这项工作得到了美国癌症协会研究奖（RSG-10-067-01-TBE）给陈和明的支持。

参考文献

Fantozzi，A.和Christofori，G.（2006）。乳腺癌转移的小鼠模型乳腺癌研究 8（4）：212.

Liu，S.，Jin，K.，Hui，Y.，Fu，J.，Jie，C.，Feng，S.，Reisman，D.，Wang，Q.，Fan，D.，Sukumar， Chen，H。（2015）。 HOXB7促进恶性进展通过激活TGFβ信号通路。 Cancer Res 75（4）：709-719。

Slamon，DJ，Clark，GM，Wong，SG，Levin，WJ，Ullrich，A.and McGuire，WL（1987）。人乳腺癌：复发和存活与HER-2/neu癌基因扩增的相关性 Science 235 4785）：177-182