材料和试剂

过滤纸
塑料罐
年轻 Vigna mungo 植物
白蛾（ Bemisia tabaci ）
HgCl <2>
TruSeq小RNA文库制备试剂盒（Illumina，目录号：RS-200-0012）
Trizol试剂（Invitrogen，USA）
异丙醇
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（Merck Millipore，目录号：623100281001730）
T4 RNA连接酶2，截短（New England Biolabs，目录号：M0242）
Tris-HCl pH 7.5
MgCl 2
DTT
ATP
PEG8000
SuperScript II逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18064014）
TEMED（Merck Millipore，目录号：623171280051730）
过硫酸铵（默克密理博公司，目录号：623171100101730）
10x TBE缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9865）
UltraPure TM糖原（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10814-010）
3 M乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7899-100ml）
无水乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：Q32854）
高灵敏度DNA试剂盒（Agilent Technologies，目录号：5067-4626）
T4 RNA连接酶2缓冲液（参见配方）

设备

电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Sub GT Cell）
生物分析仪（Agilent Technologies，型号：Agilent 2100）
热循环仪，DNA引物循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：PTC-0200G）
Qubit 3.0荧光计（Life Technologies）
Illumina基因组分析仪IIx（Illumina）

软件

Cutadapt-0.9.3
Bowtie-0.12.7
SeqQCv2.1
BLAST（Rfam和miRBase）

程序

植物材料和生长条件
1. 使用young V。 mungo 植物。表面消毒成熟种子（0.1％HgCl 2 10分钟），并在双蒸水中漂洗两次并保持在润湿的滤纸中以在28±2℃，16/8h光/暗处发芽光周期和70％相对湿度下培养1天。执行此实验的三次重复。
2. 在塑料盆中播种预发芽的种子，并且在Soilrite土壤混合物（剥落的蛭石，爱尔兰泥炭苔和混合物）中在受控的温室条件（温度26±2℃，相对湿度70％，光周期16小时和8小时夜）珍珠岩以1/3：1/3：1/3的比例）。
3. 当它们的第一片三叶叶完全膨胀（发芽后约21天）时，给予具有类似生长的植物的MYMIV胁迫。
  
  图1。
MYMIV应激治疗

在保持在实验农场，Madhyamgram，Bose Institute的保育设施中的昆虫证明笼中生长的易感黑色植物上的后白蝇（ Bemisia tabaci ）。

在透明玻璃捕捉器中捕获约25-30个成年白蝇，并且在自然感染的黑色植物的有症状的叶子上允许24小时获取进入期（AAP）（图1）。

在健康植物叶片上的有毒粉虱的玻璃捕捉器中给予24小时接种进入期（IAP），从而将病毒颗粒从有毒的苍蝇传播到植物（图2）。

图2. MYMIV接种的Trapper方法

使用引物MYMIV-外壳蛋白（CP）基因（CP-F：5'-GAA ACCTCGGTTTTACCGACTGTATA G-3'），通过PCR扩增MYMIV外壳蛋白（575bp片段; Gen-Bank登录号：HQ221570）和CP-R：5'-TTGCATA CACAGGATTTG AGGCATGAG-3'）。
小RNA文库制备

根据'中概述的Illumina TruSeq小RNA文库操作程序构建小RNA文库以进行测序 TruSeq small RNA sample preparation guide '（Part＃15004197; Rev. E; February 2013）（图3）。

使用Trizol试剂手动分离10μg总RNA（RIN值为8及以上），并用2倍体积的冷冻异丙醇浓缩，然后在15％变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，然后切除18-0的范围内的小RNA片段并从凝胶中纯化。使用T4 RNA连接酶2在缓冲液（参见配方1）中通过在25℃孵育1小时将3'和5'接头连接到小RNA。

通过用15μl含有0.15μldNTP混合物（100mM），1μl逆转录酶（50U /μl），10×缓冲液（1.5μl）的反应混合物中的衔接子特异性引物引发用Superscript II逆转录酶逆转录连接的产物，，RNA酶抑制剂（0.2μl），水（4.2μl），3μlRT引物和5μlRNA。将反应混合物在42℃下孵育1小时，随后在85℃下热灭活5分钟。

通过15个循环的低周期PCR扩增（在98℃初始变性30秒; 15个循环的98℃10秒，60℃30秒，和72℃15秒），来富集cDNA;随后在72℃最终延伸10分钟）以产生用于深度测序的完整模板并使用聚丙烯酰胺凝胶清洁，随后使用糖原，3M乙酸钠和无水乙醇进行过夜凝胶洗脱和盐沉淀。将沉淀物重新悬浮在不含核酸酶的水中。

使用Qubit荧光计（50 ng /μl）定量准备的文库，并通过在高灵敏度DNA试剂盒上运行等分试样来验证质量。

图3。 TruSeq小RNA样品制备流程图

使用软件/程序（如cutadapt-0.9.3（Martin，2011），bowtie-0.12.7（Langmead和Salzberg，2012），SeqQCv2.1（DeLuca等人，2012））分析小RNA，和BLAST（Altschul等人，1990）。分析步骤如下：

排序示例读取文件
从GAIIx排序生成fastq文件，并用于下游分析。

序列读取质量控制（QC）报告
对来自不同泳道的不同样品的所有产生的序列读数进行QC（Mugasimangalam等人，正在制备的手稿）。基于高质量读数的百分比来考虑所有测序读取的QC报告，读取中70％的碱基具有> 20 phred得分。基于根据QC（HQ读数> 90％）的分析，报告过程进一步测序

修剪读取
使用cutadapt-0.9.3进行修整以从原始小RNA序列中除去连接的接头序列。 Cutadapt工具从fastq文件中删除用户指定的序列（Martin，2011）。

生成唯一的读取和计数
通过编写自定义脚本并生成读取计数来识别唯一读取。下面简要描述的步骤进行：
删除长度小于或等于15个碱基的读数。考虑其长度在16至36个碱基范围内的读数。识别唯一序列并删除重复序列。通过确定序列数据中存在多少次，为每个唯一读取生成读取计数。

SnoRNA，SnRNA，rRNA，tRNA的注释
使用bowtie-0.12.7将序列与大豆基因组比对。 Bowtie支持fastq读取到参考fasta文件的端对端比对（Langmead等人，2009）。端到端比对仅考虑那些与参考fasta文件完全与3个错配匹配的读数。使用BLASTn（Altschul等人，1990）针对Rfam数据库（使用默认参数）检查与多达3个错配匹配的读数，以鉴定测序数据中的其他小RNA（Meyers等人，/em>。，2008）。

miRNA注释
检查由BLASTn（E值截止为10）的唯一序列对miRbase数据库以鉴定已知的miRNA。 Blast基于参考和查询之间的序列同源性（唯一读取）来识别相似的序列

食谱

T4 RNA连接酶2缓冲液
31mM Tris-HCl pH7.5
6.3mM MgCl 2 v/v 0.63mM DTT
0.2 mM ATP
5.2％PEG8000

致谢

该协议的原始版本在Paul等人中描述。（2014年）。这项工作得到印度新德里科学和工业研究理事会荣誉名誉科学家项目[第21（0884）/12/EMR-II号]的支持。

参考文献

Altschul，SF，Gish，W.，Miller，W.，Myers，EW和Lipman，DJ（1990）。基本局部比对搜索工具 215（3）：403-410。
DeLuca，DS，Levin，JZ，Sivachenko，A.，Fennell，T.，Nazaire，MD，Williams，C.，Reich，M.，Winckler，W。和Getz，G。（2012） ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22539670"target ="_ blank"> RNA-SeQC：用于质量控制和过程优化的RNA-seq指标。 a> Bioinformatics 28（11）：1530-1532。
Langmead，B.，Trapnell，C.，Pop，M.and Salzberg，SL（2009）。短DNA序列与人类基因组的超快速和记忆效率比对。基因组生物学 10（3）：R25。
Langmead，B。和Salzberg，SL（2012）。使用Bowtie 2的快速间隙读取校准。 Nat Methods 9（4）：357-359。
Martin，M.（2011）。 Cutadapt删除适配器序列从高通量测序读取。 EMB J 17（1）：第10-12页。
Meyers，BC，Axtell，MJ，Bartel，B.，Bartel，DP，Baulcombe，D.，Bowman，JL，Cao，X.，Carrington，JC，Chen，X.，Green，PJ，Griffiths-Jones，，Jacobsen，SE，Mallory，AC，Martienssen，RA，Poethig，RS，Qi，Y.，Vaucheret，H.，Voinnet，O.，Watanabe，Y.，Weigel，D。和Zhu，JK（2008） ; 植物MicroRNA的注释标准 Plant Cell 20（12）：3186-3190。
Mugasimangalam，R.，Mohan，K.，Jayakumar，V.，Ashick，M. M.，Kapila，G.and Niranjan，V.SeqQC：rapid quality control of next generation sequence data（正在准备的手稿）。
Paul，S.，Kundu，A。和Pal，A。（2014）。 15-23。
TruSeqsmall RNA样品制备。 Illumina公司。