材料和试剂

15ml Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352095）
3.5cm直径的琼脂平板（Corning，目录号：430165）
Caenorhabditis elegans
洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）复合物（Bcc）菌株
E。大肠杆菌 OP50
NaOH
漂白剂（极光）
NGM琼脂
PGS琼脂
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
胰蛋白胨（Conda，目录号：1612）
酵母提取物（Conda，目录号：1702）
蛋白胨（Conda，目录号：1602）
欧洲琼脂（Conda，目录号：1800）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C3045）
葡萄糖（Conda，目录号：1900）
山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
LB肉汤（见配方）
NGM琼脂培养基（见配方）
PGS琼脂培养基（见Recipes）
M9缓冲区（请参阅配方）

设备

离心机
20°C室
37℃振荡培养箱
解剖显微镜
铂金回线

软件

Graph-pad Prism 5软件

程序

第1天
1. 将蠕虫与漂白协议同步：使用 C。 elegans板，具有许多妊娠雌雄同体（Stiernagle，2006）。用无菌H 2 O洗涤平板。
2. 在无菌的15ml Falcon管中收集液体。加入H 2 O至总体积为3.5ml。
3. 将0.5ml 5N NaOH与1ml漂白剂混合。使该溶液在使用前清新！添加到带有蠕虫的离心管中。
4. 涡旋管几秒钟。每2分钟重复涡旋，共10分钟。
5. 在离心机中以1300×g离心管中30秒以沉淀释放的蛋。
6. 吸出至0.1 ml
7. 将无菌H 2 O添加至5ml。漩涡几秒钟。
8. 重复步骤A6和A7。
9. 将剩余的0.1ml液体中的蛋转移到接种有E的干净NGM板的边缘。大肠杆菌 OP50草坪并在20℃下孵育注意：如果你使用线虫突变体，在高温下不改变它们的固有性质，你可以在25°C孵化鸡蛋，因为一些突变体生长得比WT慢。
10. 在含有3ml LB的15ml Falcon管中接种Bcc菌株，并在振荡条件（220rpm）下将管在37℃下孵育24小时。
  注意：作为对照，使用大肠杆菌OP50代替Bcc毒株
第2天
1. 将1.7cc/ml的Bcc培养物标准化，并在含有3ml NGM琼脂（缓慢杀伤测定，SKA）或PGS琼脂（快速杀灭测定，FKA）的3.5cm直径平板上接种50μl培养物。孵育板O/N在37℃。
  注意：在37℃下孵育Bcc菌株不应超过16小时。不要将Bcc种子板存放在4°C，因为许多这些病原体对温度非常敏感，这可能导致变异。
2. 检查蠕虫的发育阶段。 24小时后，蠕虫应在幼虫阶段L2或L3，当生长在20°C。
第3天
1. 在幼虫阶段4（L4）用M9缓冲液洗涤同步的蠕虫，并将其收集在15ml Corning管中。
2. 用M9缓冲液洗涤蠕虫2-3次以除去残留的细菌细胞。
3. 点播30-40 L4蠕虫在播种Bcc菌株的板上（5个复制品）。
  注意：在添加蠕虫之前，板应保持在室温以在37℃孵育后将其冷却。
4. 在时间0计数蠕虫。将板在20℃下孵育，并且每天计数存活的蠕虫直到第5天（对于FKA）和第6天（对于SKA）。
  注意：当它不再响应用铂丝轻轻触摸时，蠕虫被认为死亡。
5. 在实验结束时，计算存活蠕虫的平均百分比。
6. 评估Bcc致病性。毒力等级（VR）的范围从0到3，它是基于观察后存活的蠕虫的百分比。当在观察期结束时存活的蠕虫的百分比为100％至80％时，认为Bcc菌株是非致病性的（VR = 0）; VR = 1对应于79％至50％的蠕虫存活的百分比; VR = 2对应于49％至6％的蠕虫活的百分比;最后，当存活蠕虫的百分比≤5％时，VR被认为是3（图1）
  
  图1.用E处理的L4阶段WT蠕虫的Kaplan-Meier存活图。在PGS（虚线）上的大肠杆菌 OP50（实线），在伯明翰金属上（虚线），的蠕虫在第0天.Bcc菌株的致病性B。在SKA（n = 80）上的能力与FKA（n = 113）上的能力进行比较。

数据分析

可以使用Graph-pad Prism 5软件产生并分析Kaplan-Meier存活曲线。比较两者的对照。 elegans 是使用Fisher精确检验进行的，以考虑数据中可能的非正态性。 Bonferroni-Holm校正 P 值用于说明执行的多重比较。更多细节可以在Tedesco 中找到。（2015）。

笔记

这些方案对于鉴定毒性Bcc菌株非常有用，并且具有高重现性。然而，可以观察到死亡率百分比的轻微变化，因为线虫是体内模型。为了使这些变化最小化，蠕虫和Bcc株应当始终在相同的条件下使用相同的温育时间和温度来维持。
主要关注依赖于线虫的幼虫阶段。只有幼虫阶段4的蠕虫应该使用。这是因为幼虫阶段L3或L2的蠕虫可能更容易受病原体影响，而较老的蠕虫携带卵，这可能阻碍计数过程。
时间是中心。请计划您的实验，以便可以使用同时准备的板和动物进行实验。
Bcc菌株在两种测定中可以显示不同的VR。在我们的研究中，我们发现了致病性的高变异性：菌株B。 metallica LMG 24068和 B。稳定 LMG 14294在两种测定中具有最大得分，而。 cepacia LMG 1222在FKA中具有VR = 3，在SKA中VR = 1。 B。 multivorans LMG 13010在两种测定中都没有显示出致病性，在所有VR = 0。

食谱

LB肉汤（1L）
10克NaCl
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
将H <2> O添加到1 L
通过高压灭菌消毒。
NGM琼脂培养基（1L） 2.5克蛋白胨 17克欧洲琼脂
2.9克NaCl
将H <2> O添加到1 L
通过高压灭菌消毒。
在溶液冷却后，加入1ml高压灭菌的/无菌的1M MgSO 4，1ml高压灭菌/无菌，1M CaCl 2，25ml高压灭菌/无菌1M KPO 4， sub> 4，1ml胆固醇5mg/ml溶于100％乙醇中
PGS琼脂培养基（1L） 12克蛋白胨
12克葡萄糖 27.25g山梨醇 17克欧洲琼脂
2.9克NaCl
将H <2> O添加到1 L
通过高压灭菌消毒。
在溶液冷却后，加入1ml高压灭菌的/无菌的1M MgSO 4，1ml高压灭菌/无菌，1M CaCl 2，25ml高压灭菌/无菌1M KPO 4， sub> 4，1ml胆固醇5mg/ml溶于100％乙醇中
M9缓冲液（1 L）
3g KH sub 2 PO 4 sub
6g Na 2 HPO 4
5克NaCl
将H <2> O添加到1 L
通过高压灭菌消毒。
溶液冷却后，加入1ml高压灭菌的/无菌的1M MgSO 4

致谢

本研究中使用的线虫菌株由CGC提供，CGC由NIH研究基础设施计划办公室（P40OD010440）资助。本研究中使用的洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）复合菌株由比利时根特大学Peter Vandamme教授友情提供。这项工作得到EU-KBBE 2012-2016项目PharmaSea，拨款号312184的支持。

参考文献

Cardona，ST，Wopperer，J.，Eberl，L.and Valvano，MA（2005）。复杂菌株在秀丽隐杆线虫宿主模型中的不同致病性。 FEMS Microbiol Lett > 250（1）：97-104。
Kothe，M.，Antl，M.，Huber，B.，Stoecker，K.，Ebrecht，D.，Steinmetz，I.和Eberl，L。（2003）。通过 Burkholderia cepacia 杀死Caenorhabditis elegans 细胞微生物 5（5）：343-351。
Stiernagle，T。（2006）。维护C。 elegans 。 WormBook 。
Tedesco，P.，Visone，M.，Parrilli，E.，Tutino，ML，Perrin，E.，Maida，I.，Fani，R.，Ballestriero，F.，Santos，R.，Pinilla， Schiavi，E.，Tegos，G。和de Pascale，D。（2015）。使用秀丽隐杆线虫感染模型研究宿主多药耐药相关蛋白转运蛋白家族在洋葱伯克霍尔德杆菌复合物致病性中的作用。 PLoS One 10（11）：e0142883。