材料和试剂

0.2μm过滤器（VWR，目录号：28145-501）
E。大肠杆菌BL21-RIL（Agilent Technologies，目录号：230280）
去离子水
氨苄青霉素（VWR，目录号：97061-442）
氯霉素（VWR，目录号：EM-3130）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
Luria broth（EMD Millipore，目录号：71751）
山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
IPTG（Teknova，目录号：I3325）
Tris缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
脱氧胆酸钠（Geno Technology，目录号：DG090）
Nonidet（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
溶菌酶（VWR，目录号：CA-EM5960）
β-巯基乙醇（BME）（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
CAPS缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：C2632）
月桂酰肌氨酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L9150）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5767）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
HEPES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
补充有0.25M山梨醇（参见Recipes）的LB培养基
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液-1（见配方）
洗涤缓冲液-2（见配方）
溶解缓冲液（参见配方）
透析缓冲液-1（参见配方）
透析缓冲液-2（参见配方）

设备

玻璃器皿
高压灭菌器（Panasonic，型号：MLS-3781L）
用于灭菌的过滤装置（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：596-4520）
生物罩（Labconco，型号：3440009）
注意：此产品已停产。
冰箱或冷藏室
温控摇床培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：MxQ ^TM 6000）
磁力搅拌板（VWR，目录号：97042-626）
UV/Vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：NanoDrop-2000）
用于SDS-PAGE（Mini-PROTEAN Tetra TM垂直电泳池）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658004）的装置
400瓦特超声波仪（All-Spec，BRANSON，型号：S450D）
冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：RC 6 Plus）
10kDa MWCO PES聚能器（Vivaproducts，型号：Vivaspin 20）
Superdex 200尺寸排阻色谱柱，120ml容量（GE Healthcare，目录号：17-1069-01）注意：此产品已停产。
Akta FPLC系统（或类似的液相色谱系统）
透析盒（Slide-A-Lyzer TM透析盒G2,10kDa MWCO）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：87730）

程序

细胞培养和蛋白表达
克隆的细节可以在Vandavasi等人的中找到。（2016年）。含有表达来自A的CESA1的催化结构域（氨基酸341-845; MW：59.7kDa）的基因的质粒（pET300NT） thaliana （AtCESA1catD）转化为E。大肠杆菌BL21-RIL菌株用氨苄青霉素和氯霉素作为选择标记并在-80℃保存为30％甘油原液。质粒DNA可以从Oak Ridge国家实验室的Hugh O'Neill博士处索取
1. 用冷冻甘油储备液的一滴接种补充有氨苄青霉素（100μg/ml）和氯霉素（35μg/ml）的50ml LB培养基的发酵剂培养物，并在振荡培养箱中在37℃下振荡为250rpm。
2. 将25ml起始培养物转移到补充有0.25M山梨醇，氨苄青霉素（100μg/ml）和氯霉素（35μg/ml）的1L LB培养基中。
3. 在37℃下生长1L培养物，直到在分光光度计（OD 600nm）中在600nm测量的光密度达到0.3-0.4（约2.5小时的生长）。
4. 将培养箱的温度改变为16℃，并继续细胞生长15-20分钟，并监测OD 600nm。当OD 600nm达到0.5-0.6时，去除1ml用于SDS-PAGE分析的培养物（预诱导样品）。
5. 当OD 600nm为0.5-0.6时，向培养物中加入IPTG至终浓度为1mM以诱导AtCESA1catD的表达。
6. 孵育培养物在16℃下10-12小时。取出0.25ml细胞（诱导后样品）用于SDS-PAGE分析
7. 通过在4℃和7,000xg离心15分钟收获细胞，并将细胞沉淀物保存在-80℃。
8. 使用SDS-PAGE分析诱导前和诱导后样品中AtCESA1catD的表达水平（图1）。
  
  图1.诱导前和诱导后的SDS-PAGE分析。泳道1：预诱导的全细胞;泳道2,3：后诱导的全细胞;泳道4,5：来自后诱导的细胞的可溶性级分;泳道6：M w w标记。与泳道1相比，在泳道2和泳道3中用箭头标记的约59kDa的强带代表AtCESA1catD蛋白的诱导。
包涵体的溶解，提取和纯化
1. 在裂解缓冲液中重悬细胞沉淀。每克细胞（湿重）5ml裂解缓冲液对我们来说效果最好。
2. 孵育细胞在裂解缓冲液在冰上30分钟。偶尔用移液管混合内容物。
3. 超声细胞悬浮液。我们使用1.3cm（直径）喇叭和400瓦特超声波仪以50％功率施加6个脉冲，每个脉冲30秒。在连续脉冲之间包括60秒的冷却时间，以避免样品的加热
4. 将细胞裂解物在36,000×g离心30分钟，在4℃下分离上清液和不溶性部分。
5. 弃去上清液并用20ml洗涤缓冲液-1洗涤不溶性级分。洗涤包括使用移液管在20ml洗涤缓冲液-1中连续重悬不溶性级分，随后在36,000×g离心30分钟。重复洗涤3次。
6. 现在用洗涤缓冲液-2洗涤不溶性级分三次。
  注意：此步骤非常重要，可以通过使用SDS-PAGE监测不溶性馏分中杂质的去除来优化。
7. 在该阶段，不溶性级分包含可以溶解在溶解缓冲液中的包涵体，或者可以在-80℃下储存以长期储存。包涵体每升培养物中含有约100mg蛋白质，因此建议在储存之前将蛋白质分成较小的等分试样。
在4℃下包涵体的溶解和尺寸排阻色谱法
1. 通过温和地移液并在轻微混合下在冰上孵育20-30分钟，使通过1L培养物获得的包涵体在10ml冰冷的溶解缓冲液中溶解。
2. 30分钟后，将全部内容物以16,000×g离心45分钟以除去不溶性杂质。收集上清液并检查280nm处的吸光度以估计蛋白质浓度。 AtCESA1catD的消光系数为80,510M ^-1 cm ^-1。
3. 溶解的蛋白质的最终蛋白质浓度应在15-20mg/ml的范围内。高浓度的样品是使用尺寸排阻色谱法实现有效分离的先决条件。如果需要，使用10kDa MWCO PES浓缩器将样品浓缩至15-20mg/ml。
4. 使用Akta FPLC色谱系统
5. 在溶解缓冲液中平衡Superdex 200（120ml）柱。
6. 通过0.2μm膜过滤器过滤溶解的样品，并将1-2ml 15-20mg/ml样品加载到Superdex 200（120ml）柱上。将流速设置为1 ml/min。在尺寸排阻色谱中，样品体积对于优化蛋白质的分离是至关重要的。对于120ml柱，最佳样品体积在1-2ml的范围内。相对高浓度的样品（15-20mg/ml）和小样品体积的组合导致相对高浓度的目标蛋白质的分辨峰。
7. 收集级分（1ml）用于使用SDS-PAGE分析，以判断纯度（参见图2和图3）。使用10KDa MWCO PES浓缩器将馏分与纯的AtCESA1混合并浓缩至10-15mg/ml。例如，图3中的SDS-PAGE凝胶的泳道3-7代表图2中洗脱曲线的主峰部分。这些是合并用于进一步研究的部分。
8. 将浓缩的纯样品（1-5ml）对1L透析缓冲液-1透析24小时，得到单体形式的纯催化结构域。
  
  图2.通过Superdex 200（120ml）色谱柱的AtCESA1catD的代表性洗脱曲线。加载1.5ml样品。级分为1ml，流速设为1ml/min。吸光度以毫吸光度单位表示。
  
  图3.来自Superdex 200（120ml）尺寸排阻色谱的级分。泳道1：标记;泳道2-8：来自尺寸排阻色谱的级分53至59
在4℃下将单体低聚成三聚体
1. 单体蛋白通过在透析期间逐渐去除月桂酰肌氨酸钠而自组装成三聚体。通常，在4℃下，将1ml蛋白质浓度为10-15mg/ml的单体蛋白质1-2ml相对于1L透析缓冲液-2透析48小时。可以通过使用动态光散射（DLS）测量样品的流体动力学半径来监测单体蛋白质到三聚体中的寡聚化（Vandavasi等人，2016）。

数据分析

此过程不需要特殊的数据处理或分析。

笔记

IPTG诱导：当OD 600nm为0.5-0.6时，向培养物中加入IPTG至终浓度为1mM，以诱导AtCESA1catD的表达。基于我们的经验，该步骤是非常重要的，因为我们发现如果OD 600nm超过0.8，则不诱导蛋白质表达。
蛋白质浓度：我们建议使用带有PES（聚醚砜）膜的浓缩器来浓缩CESA蛋白，因为碳水化合物结合蛋白可以与再生纤维素膜的浓缩器结合。

食谱

补充有0.25M山梨醇的LB培养基将20g LB（来自酪蛋白的蛋白胨：10g;酵母提取物：5g; NaCl：5g）溶解在750ml超纯水中，并通过高压灭菌进行灭菌。准备250ml的1M山梨糖醇，并通过0.2μm过滤器过滤灭菌在无菌条件下混合LB和山梨醇
裂解缓冲液
20mM Tris-HCl，pH8.0 200 mM NaCl
0.2mg/ml溶菌酶
洗涤缓冲液-1
20 mM Tris，pH 8.0
1％脱氧胆酸钠 1％Nonidet
10mM BME
洗涤缓冲液2
20 mM Tris，pH 8.0
1％Triton X-100
溶解缓冲液
50mM CAPS（pH 10.5） 0.2％（w/v）月桂酰肌氨酸钠 0.2 M葡萄糖
3％（v/v）甘油 5 mM DTT
注意：溶解缓冲液的pH应在室温（25℃）下测定10.5。我们发现， 10.5蛋白质不容易溶解。
透析缓冲液-1
50 mM CAPS，pH 8.0
0.2％（w/v）月桂酰肌氨酸钠 0.2 M葡萄糖
3％（v/v）甘油 5 mM DTT
透析缓冲液-2
20mM HEPES，pH 8.0
50mM NaCl 10％甘油 5mM DTT

注意：
a。使用NaOH调节本协议中使用的所有缓冲液的pH。 b。使用0.2μm过滤器无菌过滤所有缓冲液。

致谢

这项工作得到了由UT-Batelle，LLC管理的Oak Ridge国家实验室（ORNL）的实验室指导研究和开发计划的支持，美国能源部（DOE），合同号为DE-AC05-00OR22725，中心为木质纤维素结构和形成（CLSF），由美国能源部，科学办公室，基础能源科学办公室资助的能源前沿研究中心。
该手稿由UT-Battelle，LLC在与美国能源部签订的合同号为DE-AC05-00OR22725的条款下创作。美国政府保留并且出版商接受该出版物，承认美国政府保留一个非排他性，已缴纳，不可撤销的世界范围的许可证出版或复制这份手稿的出版形式，或允许他人这样做，为美国政府的目的。能源部将根据DOE公共访问计划（ http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan ）。

参考文献

Vandavasi，VG，Putnam，DK，Zhang，Q.，Petridis，L.，Heller，WT，Nixon，BT，Haigler，CH，Kalluri，U.，Coates，L.，Langan，P.，Smith，JC，Meiler ，J.和O'Neill，H。（2016）。