材料和试剂

棉签
培养皿（90mm）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：101IRR）
24孔细胞培养板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：142475）
玻璃载玻片（Biomedical Sciences Institutes，目录号：BMH.880103）
Fisherbrand TM盖玻片（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-545-81）
清除指甲油
小鼠
巴豆油（Sigma-Aldrich，目录号：C6719）
Veet脱毛膏
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
丙酮（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：67-64-1）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：10735108001）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
抗体

PE抗小鼠Ly-6G抗体（克隆1A8）（BioLegend，目录号：127607）
PE大鼠IgG2a，κ同种型对照抗体（克隆RTK2758）（BioLegend，目录号：400507）
APC抗小鼠CD31（克隆MEC 13.3）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：561814）

安装介质（ibidi，目录号：50001）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9564）
染色和洗涤缓冲液（1％BSA的PBS溶液）（参见配方）

设备

移液管（Eppendorf，型号：Eppendorf Research plus）
解剖剪刀（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-6702）
钳（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-5240; RS-5135）
振动器（Labnet）
Zeiss LSM 510 Meta共焦显微镜（Zeiss）

软件

ImageJ软件（美国国家卫生研究院）（ https：//imagej.nih .gov/ij/index.html ）

程序

用移液管在每只耳朵的背侧涂20μl新鲜制备的1％巴豆油（丙酮溶液）。
3小时后牺牲小鼠。使用棉签用Veet去除耳朵背侧的毛发（图1A）。 3分钟后用棉签用PBS洗去Veet。重复，直到Veet完全去除（图1B）。

图1.从小鼠耳朵取出头发。 A.使用棉签在耳背侧应用Veet。 B. 3分钟后，用棉签用PBS完全除去Veet
收获耳朵。使用镊子在培养皿上将耳朵分成两半，收集背侧（图2）。

图2.收集耳朵样本。A.用剪刀和镊子收获耳朵。 B.使用镊子将耳朵分成两半。
将背侧耳朵转移到24孔板中，并用1ml丙酮在-20°C固定20分钟。
取出丙酮，在室温下用24孔板中的1ml染色剂和洗涤缓冲液洗涤3次
通过添加50微升Ly6G PE /同种型对照PE和CD31 APC（染色和洗涤缓冲液中的1:100）到24孔板上的耳朵半部分染色。在室温下振荡孵育1小时
在室温下在24孔板中用1ml染色剂和洗涤缓冲液洗涤3次
将半耳朵转移到玻璃罩上。用10μl含DAPI（1：1,000）的固定介质安装到载玻片上，并用透明指甲油密封（图3）。

图3.将耳朵样品安装到载玻片上。 A.将安装介质添加到耳朵半部。 B.玻璃上的耳朵半部分安装在玻璃载玻片上
在共聚焦显微镜下可视化。使用HeNe 543（Cy3）和HeNe633（Cy5）激光器（图4）在20x物镜下的图像。

图4.用抗Ly6G（红色）和具有抗CD31（绿色）的血管显现嗜中性粒细胞。图4.在局部应用巴豆油3小时后，在整体耳朵中嗜中性粒细胞的免疫荧光染色。比例尺，50μm。

数据分析

从 https://imagej.nih.gov/ij/下载ImageJ软件index.html 。
在ImageJ中打开图片。
如有必要，调整图像的亮度或对比度：
图像→调整→亮度/对比度
覆盖两个荧光通道：
图像→堆叠→堆叠到图像
图像→颜色→合并通道...
将图片导出为TIFF文件。

笔记

毛发去除对于最小化成像期间的自发荧光是重要的
同种型对照确保Ly6G染色的特异性

食谱

染色和洗涤缓冲液（1％BSA的PBS溶液） 1 g BSA
200μl10％叠氮化钠
100 ml PBS

致谢

该协议改编自Gunawan等人以前发表的论文的实验程序。（2015）。这项工作得到了新加坡国家研究委员会的支持（NMRC/CBRG/0057/2014）。

参考文献

Gunawan，M.，Venkatesan，N.，Loh，JT，Wong，JF，Berger，H.，Neo，WH，Li，LY，La Win，MK，Yau，YH，Guo，，S，Chin，KC，Gingras，AR，Shochat，SG，Ng，LG，Sze，SK，Ginhoux，F.and Su，IH（2015）。甲基转移酶Ezh2通过核外调节蛋白talin的直接甲基化来控制细胞粘附和迁移。 Immunol 16（5）：505-516。

Hampton，HR，Bailey，J.，Tomura，M.，Brink，R.和Chtanova，T。（2015）。嗜中性粒细胞的微生物依赖性淋巴迁移调节淋巴结中的淋巴细胞增殖。 Nat Commun 6：7139.

股票，AT，史密斯，JM和Carbone，FR（2014）。 I型IFN在病毒感染期间抑制Cxcr2驱动的嗜中性粒细胞募集到感觉神经节中。 211（5）：751-759。