材料和试剂

26号针
1或3毫升注射器
显微镜载玻片
CellTram Vario注射器
10厘米组织培养皿
所需的核或线粒体遗传背景的女性供体小鼠（3-4周龄）
作为捐赠者女性的匹配核背景的雄性育种者（经证明）
女性受体小鼠（8-10周龄）
切除的雄性小鼠（经证实）
来自怀孕母马血清（PMS）（Sigma-Aldrich，目录号：G4877）的促性腺激素
注意：此产品已停产。
人绒毛膜促性腺激素（HCG）（Sigma-Aldrich，目录号：CG10）
M2培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M7167）
来自Drechslera dematioidea的细胞松弛素B（Sigma-Aldrich，目录号：C6762）
Colcmid（Sigma-Aldrich，目录号：D1925）
胚胎测试的矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410）
胚胎移植用水（Sigma-Aldrich，目录号：W1503）
限制酶：

BclI（New England Biolabs）
PflF1/AspI（New England Biolabs）

稀释PMS（参见配方）
HCG的稀释（参见配方）
细胞松弛素B的稀释（参见配方）
秋水仙的稀释（见配方）

设备

压电钻（压电钻）（Sutter仪器，型号：PrimeTech PMM-150FU）
电穿孔仪（BTX The Electroporation Experts，型号：ECM 630）
微量移液器（水平移液管拉出器）（Sutter Instrument，型号：P-87）
产品P-87已停产，可用的产品是P-97。
Micropipette微型铸造（Defonbrune微型铸造显微镜头）（Leitz）
保持移液器拉出器（垂直移液器拉出器）（David Kopf Instrument，型号：720）
显微镜（Laborlux S Nomarski DIC）（Leica Microsystems）
CellTram Vario注射器（Eppendorf）
台式孵化器（Cook，型号：MINC G20079）
45度角钳（Fine Science Tools，目录号：11251-35）
直镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-10）
微切割弹簧剪（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-5650）
嘴移液器

程序

创建MNX小鼠

图1.整个程序示意图。通过从"菌株A"（C57BL/6）和"菌株B"（C3H/HeN）小鼠摘除受精卵细胞产生MNX小鼠。 MNX命名由菌株核（Strain ）表示：菌株mtDNA（Strain ），例如。具有C3H核DNA和C57的小鼠mtDNA由C3H支持物表示：C57 mt 。将菌株B原核转移至去核的菌株A卵母细胞，产生菌株B：菌株A （C 3 H ：C57 < ）卵母细胞，将其植入替代雌性以产生MNX后代。遵循相互过程以产生菌株A ：菌株B （C57 ：C3H mt ）：卵母细胞
1. 使用26号针头和1或3ml注射器，用PMS（5.0-7.5IU，体积0.2-0.3ml）腹膜内（IP）注射雌性供体小鼠。小鼠的最佳剂量和年龄可以是菌株特异性的，并且应当通过剂量响应曲线和受精胚胎产生的评估来确定。通常，雌性小鼠在第1天中午注射。
2. 在（第3天）PMS注射后约48小时，供体小鼠接受与PMS相同剂量的IPG注射的HCG。在注射后，超排卵的雌性与配对并且与具有相同核基因型（与女性相匹配，图1）的已证明的育种雄性配对;经常交配发生在交配的前1-2小时内。通过目视检查呈阳性征象的雌性受体小鼠与证实的切除血管的雄性配对以产生假孕（Byers等人，2012）。
3. 第二天早上检查阴道栓塞的女性。插塞的存在表示成功的交配，但不一定表示受精。然而，没有插头不能确认没有发生成功的育种，因为插头的容易识别可能是应变依赖的
4. 如前所述收获菌群以产生单细胞胚（图2A和2B）（Han等人，2010）。
  
  图2.从输卵管收集卵丘块。用阴道塞从超量配置的雌性解剖输卵管（A）。肿胀的壶腹（由箭头指示）切口以允许排出胚胎和卵丘细胞（B）。
5. 通过嘴移液管将原核胚胎置于含有细胞松弛素B（5μg/ml）和秋水仙碱（0.1μg/ml）的M2培养基中，在37℃下放置5分钟，并保持在显微镜载片上的M2培养基的显微注射液滴温度以防止操作过程中的溶解
6. 使用与用于胚胎干细胞注射（大约20微米内径）的斜角移液管相似的大小和形状的微量移液管通过在第一胚胎的透明带上施加轻微压力来除去每个胚胎的原核（Longenecker和Kulkarni， 2009）。高强度压电脉冲仅施加直到zona破裂（大约1-2秒），然后关闭。将移液管缓慢推进至每个原核（图3），并且使用CellTram vario注射器将温和的抽吸施加至针，将两个原核作为单个单元（karyoplast，图3）吸出并移出。只有当原核与针接触时，适当的针尺寸和吸力的应用最小化了细胞质内容物进入针的吸收。
7. 在相互胚胎上重复该过程，导致移液管含有来自两种菌株的原核（图3）。
  
  图3.前核的分离（A）将移液管缓慢推进到每个原核（由黑色箭头指示），并使用CellTram vario注射器（B）将原核作为单个单元（karyoplast，K）吸出并移出（C）。 ZP，透明带
8. 将来自菌株A的分离的原核植入菌株B的去核胚胎中（图4）。将来自菌株B的相互的核质体置于去核的菌株A胚胎中
  
  图4.原核转移然后将来自一个菌株的核质体（K）植入到互逆菌株的去核胚胎中。 ZP，透明带。（A）插入包含核质体的移液管（B）核质体的排出（C）重建的胚胎。
9. 十厘米组织培养皿（图5）装载有30μl的M2培养基的微滴并覆盖在矿物油中，并且通过嘴移液管将每个胚胎放入其自身的培养基滴中。将菌株A和菌株B胚胎置于分开的皿中。将电极放置在将两个极之间的胚胎定位的液滴中。对每个重构的合子施加单个90V脉冲，并将所有受精卵培养过夜（Han等人，2010）。
  
  图5.胚胎培养皿。图1-8是含有重构的合子的不同的M2培养基和矿物油滴。每一滴可以含有1-2个受精卵
10. 将两个细胞的胚胎转移到0.5天假孕小鼠的输卵管口上;每个受体转移大约20个胚胎（图6）
  
  图6.重建胚胎的输卵管转移。通过口腔吸管将两个细胞胚胎通过漏斗口放入假孕受体小鼠的输卵管中。
11. 核基因型和mtDNA单倍型在后代通过核SNP和完整的mtDNA基因组序列分析从耳尾或尾夹验证。
MNX小鼠集落建立
基于对每种潜在mtDNA单倍型特异性的PCR分析，使用同质性创始者雌性MNX小鼠建立MNX小鼠集落。最初通过对每种单倍型开发的PCR检测方法和通过测序确认的同质雌性确定mtDNA单倍型。期望的同质（基于PCR筛选）在约20％-30％的产生的雌性中鉴定用作创始者的雌性。
1. MNX女性的验证mtDNA序列和表观同质性（使用耳朵或尾夹DNA）与匹配核背景的男性交叉以产生F1窝。
2. 通过对诊断mtDNA SNP特异性设计的PCR分析，测试来自F1后代的多个组织以验证期望的mtDNA单倍型/同形型（Bayona-Bafaluy等人，2003）。例如，将F1 C57阳性和C3H阳性：C57 小鼠在基于多种组织的基因组中进行单倍群分组在PCR检测方法中询问异质性的潜力（图7）。
  PCR方案：
  2x GoTaq MasterMix：25μl
  引物：每个5μl
  无核酸酶H 2 O：12.5μl
  DNA：2.5μl
  热循环特性：
  95℃2分钟：1个循环
  95℃30秒; 57℃1分钟; 72℃30秒：35个循环
  72℃10分钟：1个循环
  24°C无穷
  1. 筛选bp 9461（204碱基对扩增子）处的ND3突变：
    9461F：5'-TTCCAATTAGTAGATTCTGAATAAACCCAGAAGAGAGTGAT-3'
    9461R：5'-AAATTTTATTGAGAATGGTAGACG-3'
    在10微升反应体积中用限制酶Bcli（10U，New England Biolabs）消化10微升扩增子。 C3H mtDNA被切割成166bp和38bp片段，而C57mtDNA保持未切割。
  2. 筛选bp 9348 CO3突变（385碱基对扩增子）：
    9348F：5'-CGAAACCACATAAATCAAGCCC-3'
    9348R：5'-CTCTCTTCTGGGTTTATTCAGA-3'
    使用Pflf1（AspI，10U，New England Biolabs）限制酶在20微升反应体积中消化10微升扩增子。 C3H mtDNA保持未切割，而C57 mtDNA被消化成274bp和111bp片段。
    
    图7.线粒体 - 核交换（MNX）小鼠的生成。所有起始创始雌性和F1后代的核基因分型和mtDNA单元型通过一组38个区分核SNP的核SNP分析和完整的mtDNA测序。通过对创始人的直接测序进行初始mtDNA单倍型验证后，通过使用AspI和BclI的限制性酶长度多态性分析对后续世代进行单倍型分析，其给出C3H和C57mtDNA的不同模式。来自C57mtDNA的PCR产物保持未切割（204bp），而C3H mtDNA被BclI切割产生166bp和38bp片段。 B.来自C57 mtDNA的PCR产物被AspI切割产生274bp和111bp片段，而C3H mtDNAs保持未切割（385bp）。
3. 产生在所有测试组织中出现同质的小鼠的MNX雌性创建者然后用作每个相应MNX集落的建立水坝。
4. 使用基于PCR的技术，每一代的所有后代是mtDNA单倍群，以验证期望的遗传背景的维持。

数据分析

详细描述MNX小鼠的产生以及分析和复制信息的原始研究文献可在网上获得（Fetterman等人，2013）。

食谱

稀释PMS
将20毫升胚胎测试水加入到1000 IU瓶的冻干PMS中，以50 IU/ml产生20毫升原液。
储存于-20°C长达3个月。
稀释HCG
加入10ml胚胎测试水至10,000IU瓶的冻干HCG以在1,000IU产生10个储备物。
根据需要用20ml胚胎测试水稀释每个试管，以50IU/ml产生20ml原液 -20℃保存6周。
细胞松弛素B的稀释
加入1ml DMSO至1mg细胞松弛素B粉末，以产生1mg/ml储备溶液稀释5微升储备在1毫升M2介质为5微克/毫升的解决方案。
储存于-20°C长达6个月。
阴离子稀释
加入10μl购买的，10μl/ml秋水仙素储备溶液和1ml M2培养基以产生0.1μg/ml溶液。
储存于-20°C长达6个月。

致谢

这项工作由国家卫生研究院资助（授权号RO1 94518和RO1103859 [到SWB]），国家癌症研究基金会（DRW），Susan G. Komen治疗（授权号SAC111370 [到DRW]），US Army Medical Research&材料指令（授权号W81XWH-07-1-0540d [至S.W.B.]）和来自阿拉巴马大学在伯明翰综合癌症中心的试验性授权（授权号CA013148 [授予D.R.W.和S.W.B.]）。从美国国立卫生研究院（授予号RO1 HL109785 [到LJD]），国家卫生研究院的心血管病理生理学（授予号T32 HL007918 [到JLF]），美国心脏协会退变性奖学金（授予号）数字09PRE2240046 [to JLF]和11PRE7650033 [to KJD]）。阿拉巴马大学在伯明翰转基因小鼠设备（RAK）由国立卫生研究院[资助号P30CA13148，P30AR048311，P30DK074038，P30DK05336和P60DK079626]支持，以及由国立卫生研究院资助的糖尿病研究中心位于伯明翰阿拉巴马大学的生物分析氧化还原生物学核心[授予号P60 DK079626]。

参考文献

Bayona-Bafaluy，MP，Acin-Perez，R.，Mullikin，JC，Park，JS，Moreno-Loshuertos，R.，Hu，P.，Perez-Martos，A.，Fernandez-Silva，P.，Bai，Y 。和Enriquez，JA（2003）。重访鼠标线粒体DNA序列。 Nucleic Acids Res 31（18）：5349-5355。
Betancourt，AM，King，AL，Fetterman，JL，Millender-Swain，T.，Finley，RD，Oliva，CR，Crowe，DR，Ballinger，SWand Bailey，SM（2014）。
Byers，SL，Wiles，MV，Dunn，SL和Taft，RA（2012）。鼠标发现周期识别工具和图片 PLoS One 7（4）：e35538??。
费特曼，JL，Zelickson，BR，约翰逊，LW，莫勒林，DR，威斯布鲁克，DG，庇柳斯，M.，森美，MJ，约翰逊，M.，邓纳姆-Snary，KJ，曹，X.，布拉德利，WE，张，J。，Wei，CC，Chacko，B.，Schurr，TG，Kesterson，RA，Dell'italia，LJ，Darley-Usmar，VM，Welch，DRand Ballinger，SW（2013）。< a class = "KE-的insertFile的"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mitochondrial+genetic+background+modulates+bioenergetics+and+susceptibility+to+acute+cardiac+volume+overload "。目标="_空白">线粒体遗传背景调节生物能量学和对急性心脏容量超负荷的易感性。 455（2）：157-167。
Freeman，HC，Hugill，A.，Dear，NT，Ashcroft，FM和Cox，RD（2006）。烟酰胺核苷酸转氢酶的缺失：C57Bl/6J小鼠中葡萄糖不耐受的新的量化性状位点。糖尿病55（7）：2153-2156。
Grimsditch，DC，Penfold，S.，Latcham，J.，Vidgeonhart，M.，Groot，PHand Benson，GM（2000）。动脉粥样硬化 151 ）：389-397。
Han，Z.，Cheng，Y.，Liang，CG和Latham，KE（2010）。核移植。 Methods Enzymol 476（2）：171-84
Kaku，K.，Jr，FF，Province，M.and Permutt，MA（1988）。多基因控制的证据糖尿病37（6）：707-13。
Longenecker，G.和Kulkarni，AB（2009）。通过ES细胞显微注射产生基因敲除小鼠。 Curr Protoc Cell 第19章，单位19.14 19.14.1-36。
Mckenzie，M.，Trounce，IA，Cassar，CA和Pinkert，CA（2004）。生产同质异种线粒体小鼠。 Proc Natl Acad Sci U S A 101（6）：1685-1690。
Paigen，B.，Morrow，A.，Brandon，C.，Mitchell，D。和Holmes，P.（1990）。近交系小鼠对动脉粥样硬化的易感性变化。动脉粥样硬化 10（2）：65-73。
Wang，X.，Ria，M.，Kelmenson，PM，Eriksson，P.，Higgins，DC，Samneg?rd，A.，Petros，C.，Rollins，J.，Bennet，AM，Wiman， U.，Wennberg，C.，Olsson，PG，Ishii，N.，Sugamura，K.，Hamsten，A.，Forsman-Semb，K.，Lagercrantz，J.and Paigen，B。（2005） a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Positional+identification+of+tnfsf4%2C+encoding+ox40+ligand%2C+as+ a基因+影响+动脉粥样硬化+易感性"target ="_ blank"> TNFSF4的位置鉴定，编码OX40配体，作为影响动脉粥样硬化易感性的基因。 Nat Genet 37 4）：365-372
Yu，X.，Gimsa，U.，Wester-Rosenl?f，L.，Kanitz，E.，Otten，W.，Kunz，M. and Ibrahim SM（2009）。使用小鼠转化子菌株解析mtDNA变异对复杂性状的影响。 Genome Res 19（1）：159-165。