材料和试剂

2ml安全锁微量离心管（Eppendorf，目录号：022363352）
铝箔
2ml具有螺帽的Sarstedt管（SARSTEDT，目录号：72.694.007）
2ml螺旋盖自动进样器小瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，目录号：C4000-1W）*
带预切口隔片的自动进样器样品瓶盖（Phenomenex，目录号：AR0-8977-13-B）*
5/32"研磨球，440C不锈钢处理（OPS诊断，目录号：GBSS 156-5000-01）*
一次性抗静电聚丙烯粉末勺（Cole-Parmer仪器，目录号：06277-60）
注意：此产品已停产。
乙醇（Decon Labs，目录号：V1016）*
氯仿（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：C607-4）*
甲醇（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A412P4）*
丙酮（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A184）*
72％（w/w）硫酸溶液（RICCA Chemical，目录号：R81916001A）*
超纯水（Milli-Q或等效物）*
9糖：
L-岩藻糖（Fuc）（Sigma-Aldrich，目录号：F2252）*
D-葡萄糖（Glc）（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）*
D-半乳糖（Gal）（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）* D-木糖（Xyl）（Sigma-Aldrich，目录号：X1500）*
D-甘露糖（Man）（Sigma-Aldrich，目录号：M8574）*
L-阿拉伯糖（Ara）（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）*
L-鼠李糖（Rha）（Sigma-Aldrich，目录号：W373011）*
D-半乳糖醛酸一水合物（GalA）（Sigma-Aldrich，目录号：48280）*
D-葡萄糖醛酸（GluA）（Sigma-Aldrich，目录号：G5269）*
氢氧化钠溶液（50％，w/w）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：SS254）
无水乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：71183）
液氮

*注意：这些项目可以可靠地替换为来自不同供应商的实验室级别的等同项目。

设备

冷冻干燥机（Labconco，型号：FreeZone 12）*（可选）
磁铁
吸气器
金属刮刀
微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）*
与高压灭菌器兼容的机架
自动取样器
微量天平（Mettler Toledo，型号：XS105）*
球磨机（Retsch，型号：MM 400）*
任选配备有洗脱液发生器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，型号：ICS-5000 ⁺ SYSTEM）的Dionex ICS-5000 HPAEC-PAD系统
CarboPac PA-20分析柱，3×150mm（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：060142）
CarboPac PA-20保护柱，3×30mm（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：060144）
CarboPac PA-200分析柱，3×250mm（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：062896）
CarboPac PA-200 Guard柱，3×50mm（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：062895）}

*注意：这些项目可以可靠地替换为来自不同供应商的实验室级别的等同项目。

软件

Chromeleon 7（Thermo Fisher Scientific）
Microsoft Excel

程序

醇不溶残渣（AIR）的制备
1. 快速冷冻300 mg新鲜组织在2 ml Eppendorf管（注1）。如果使用更多的组织，均化和溶剂萃取将是低效的。如果植物来自琼脂固化的平板，必须小心避免与幼苗接触任何琼脂，因为它将在后面的步骤中水解和定量为Gal。如果冷冻干燥机不可用，请参见注释2并跳到步骤A6
2. 留下管的盖子打开，但用一小块铝箔覆盖开口。通过用针或移液管尖端戳一个小孔来确保箔片通风
3. 冻干样品2-3天。
4. 每管加3个钢球，关闭盖子。
5. 将干燥的样品均质化2分钟，在室温下在25Hz下摇动。反转管夹的方向，并在25 Hz下再摇动2分钟。
6. 确保在进行之前获得没有团块的细粉末。
7. 向管中加入1.5ml 70％（v/v）乙醇并涡旋。使用磁铁从浆料中取出钢球，并将其丢弃
8. 以20,000×g离心10分钟。
9. 使用与有机溶剂或移液管相容的吸气器弃去上清液。
10. 加入1.5ml 1:1（v:v）氯仿：甲醇。用小金属刮刀破碎沉淀，然后彻底涡旋样品
11. 重复步骤A8-10两次，用氯仿：甲醇洗涤总共3次。
12. 如前所述离心并除去溶剂（步骤A8-9）
13. 加入1.5ml丙酮，破碎沉淀，涡旋，离心，弃去上清液，如前
14. 通过使用真空离心机干燥最终的沉淀至少30分钟或者空气干燥过夜。所得材料是AIR（注3，图2）。
  
  图2.步骤A14后的AIR材料
一步两步水解
1. 对于每个AIR样品，在分析天平上（注4），精确称量?1mg材料至四个2ml Sarstedt管中的每一个中。避免材料块。记录每个管中AIR的精确重量。这四个管是技术重复，将经历两个不同的水解方案作为重复
2. Saeman水解样品
3. 基质水解样品
  1. 向第二组两个管中，首先加入1400μl水，然后加入50μl72％（w/w）硫酸以得到4％（w/v）浓度的硫酸。盖上管和涡流。
4. 恢复标准
  1. 制备由9种糖（Fuc，Rha，Ara，Gal，Glc，Xyl，Man，GalA和GluA）组成的标准混合物，每种浓度为100μg/ml。建议单独制备每种糖的浓缩原液，然后混合。如果使用水合糖，则计算额外的水量。准备至少足够用于本部分的协议（1毫升）以及准备标准曲线在下一部分的协议（138微升）。糖标准可以冷冻储存一次。
  2. 为了解释水解期间的糖特异性损失，使回收标准经受与基质水解样品相同的条件（注5）。移取500微升的标准混合物和900微升的水到2毫升的Sarstedt管。加入50μl的72％（w/w）硫酸。用第二个管重复。盖上管和涡流。
5. 除了一个回收标准之外，在高压灭菌器兼容的架子和高压灭菌器中，将所有试管在121℃下放置60分钟。第二回收标准管不经高压灭菌，并且用作计算单糖特异性校正因子的对照
6. 将样品冷却至室温，并在20,000×g离心1分钟，以沉淀任何不溶性物质。
7. 稀释样品，回收标准品和回收标准品对照100倍，将10μl转移到含有990μlMilliQ水的自动进样器样品瓶中。将样品在4°C储存长达两个星期。如果样品在-20°C下冷冻，可以保存一个月或更长时间。对于从茎，木材或其它次级组织制备的更多富含纤维素的AIR，对于从拟南芥幼苗分离的AIR，该稀释因子是方便的，应当使用更高的稀释因子（200-500倍）。
8. 标准曲线样本
  1. 稀释来自步骤B4的标准混合物（9种糖，各100μg/ml），得到0.05μg/ml和5μg/ml之间的标准曲线。 1 。将其直接制备到具有预切口隔片的2ml自动进样器小瓶中（表1）。该浓度范围通常覆盖仪器的完整线性范围
    表1.准备标准曲线样本
    
    *注意：标准8进一步稀释，以准备标准1-4。
HPAEC-PAD分析
1. HPAEC-PAD分析＃1（所有样品）
  1. 将25μl每种标准品，回收标准品和样品注入3 x 150 mm CarboPac PA-20分析柱，配备相同材料的3 x 50 mm保护柱。用0.4mM min -1的流速用2mM KOH洗脱化合物30分钟（注释6）。这个运行将解决Fuc，Gal，Glc，Xyl和Man。 Rha和Ara不能用这些条件一致地分开，因此它们通过只对基质水解样品必需的第二次分析来量化。
  2. 根据我们的经验，峰值的保留时间将随着更多样品的运行而更早移动，在?50-100个样品后，需要用乙酸钠进行柱子冲洗（参见下面的步骤C4）。
2. HPAEC-PAD分析＃2（仅基质水解样品）
  1. 将25μl每种标准品，回收标准品和样品注入3 x 150 mm CarboPac PA-20分析柱，配备相同材料的3 x 50 mm保护柱。用18mM KOH 0.4ml min -1 -1洗脱化合物30分钟。此运行将解决Rha和Ara。
  2. 在运行?50-100个样品后可能需要进行柱冲洗（见下面的步骤C4）。
3. HPAEC-PAD分析＃3（仅基质水解样品）
  1. 将25μl每种标准品，回收标准品和样品注入3 x 150 mm CarboPac PA-200分析柱，配备相同材料的3 x 50 mm保护柱。用100mM NaOH中50mM至200mM乙酸钠的10分钟梯度洗脱化合物，流速为0.4ml min -1 -1（这是用5％-20％梯度的5％-20％洗脱液B [100mM NaOH，1M乙酸钠]，洗脱液A由100mM NaOH组成，剩余体积）。此运行将分解GalA和GluA
4. 柱冲洗程序
  1. CarboPac PA20柱的性能在运行?50-100个样品后降解，导致越来越早的保留时间，直到峰不能充分分辨。这通过用100mM NaOH/1M乙酸钠冲洗柱30分钟，然后用0.2ml min -1 -1柱冲洗30分钟来补救。如果CarboPac PA20色谱柱与配有洗脱液发生器的HPAEC-PAD系统一起使用，则需要将其临时移至不同的系统或端口，以完成此过程。

数据分析

使用Chromeleon 7软件集成所有标准曲线和水解样品。对于校准曲线，使用强制通过原点的二次曲线。对于一些样品，峰标识可能需要手动分配，因为保留时间倾向于在多次运行时更早移动。图3-5显示了三种HPAEC-PAD方法的代表性色谱图

图3. HPAEC-PAD分析＃1代表性色谱图。 A.标准混合物。 B.Saeman水解样品。 C.基质水解样品。在?8.2min的峰包含Rha和Ara，并且在该方法中没有定量

图4. HPAEC-PAD分析＃2代表性色谱图。 A.标准混合物。 B.基质水解样品。只有Rha和Ara在这些运行中被定量。 Fuc在?3.4分钟洗脱，Gal在?7.6分钟洗脱，Glc在?8.2分钟洗脱。 ?9.0分钟的峰是Xyl和Man的混合物

图5. HPAEC-PAD分析＃3代表性色谱图。 A.标准混合物。 B.基质水解样品
从每次运行，可以将结果（测定的单糖浓度，μgml ^-1）从结果表复制到Microsoft Excel电子表格中。设置一个表格，其中列出每个糖的结果，以及每个样品的AIR质量的列（图6）。
通过将回收标准品的浓度除以回收标准品对照品中各糖的浓度，计算每种糖的校正因子。这些通常是> 0.85对中性糖，但对于糖醛酸较低（?0.6-0.8）。相同的Glc回收系数用于Saeman和Matrix水解样品。低于预期的校正因子表明由于长时间的高温处理可能发生的样品损失过多。重复水解，确保样品冷却，并在高压釜运行完成后立即稀释。
在新栏中，使用下式计算恢复标准校正的单糖量，以mg/mg AIR计：

在哪里，
c =测定浓度（μg ^-1），
d = 100（稀释因子），
v = 1.450（体积，ml），
r =恢复修正系数（从步骤C3开始），
m = AIR质量（mg）。
在这一点上，可以验证技术重复，以检查在单糖定量中是否存在任何系统差异，这将证明丢弃技术重复是合理的。（这将指示样品损失或称重误差。 Fuc，Gal和Xyl应在Saeman和Matrix水解样品中具有一致的值。 Glc在Saeman水解样品中将高得多，并且Man在这些样品中预期更丰富，因为Glc异构化为Man是Saeman水解期间的已知副反应（Carpita和Shea，1989）。这种副反应的程度仅为?2％，因此为了纤维素定量的目的而被忽略
平均技术复制到新列中。只有使用所有三种HPAEC-PAD方法的Matrix水解样品用于报告中性糖和糖醛酸。
为了计算纤维素量，从Glc总（来自Saeman水解样品）中减去Glc基质（来自基质水解样品）并乘以0.9。 0.9校正因子反映了葡萄糖（180.16g mol -1 -1）和葡糖酐（162.14g mol -1 -1）之间的摩尔质量差异，因为其发生在纤维素聚合物中水解前。
纤维素（μgmg ^{-1 AIR）= 0.9×（Glc 总的<μg>}）< > （μgmg ^-1））
对于统计分析，我们通常使用从独立植物或幼苗池制备的AIR的至少三个生物重复。结果报告为平均值，标准偏差和统计学显着性通过Student's t检验或单因素方差分析，接着通过Tukey多重比较检验来评估。

图6.示出从HPAEC-PAD整合数据计算单糖和纤维素的Excel电子数据表的屏幕截图。分析的样品是从5d老黑暗生长的拟南芥幼苗制备的。

笔记

样品中存在的任何淀粉将有助于在两种水解方案中量化的葡萄糖。如果需要定量来自基质多糖的葡萄糖，则可以在收集组织之前通过将光生长的植物移动到暗处24小时来减少淀粉（Sorek等人，2015）。或者，淀粉可以在AIR的制备期间被酶去除（Pettolino等人，2012），或者可以从相同的AIR材料独立地测定淀粉（Yeats等人， 2016）。淀粉不会影响纤维素的测定，因为它将同样对在Saeman和基质水解样品中定量的葡萄糖有贡献。
如果没有冷冻干燥器，可以直接从用研钵和杵或球磨机均质化的冷冻组织制备AIR。在这两种情况下，样品在均质化期间必须保持冷冻：在使用之前，砂浆和杵或球磨管架应浸入液氮中。管在低温下更脆，并且我们注意到在球磨机中均质化期间管的破裂速率增加，因此我们优选在室温下用干燥的组织工作。
术语AIR和细胞壁材料通常可互换使用，然而，从定量单糖的质量平衡显而易见，从幼苗制备的AIR仅为?50％细胞壁材料。用SDS和偏亚硫酸氢钠的水溶液更广泛地洗涤AIR除去额外的非细胞壁物质（Dick-Pérez等人，2011）。然而，如果要分析多个样品，则该方案是冗长的和不方便的。由于在AIR制备过程中提取和洗涤的效率可能存在差异，因此最佳做法是同时制备所有待分析的空气样品。我们发现，同时准备高达?60个AIR样品是方便的，离心机容量是一个限制因素。对于水解步骤，管的数目乘以4，因此一旦制备AIR，我们以15-20个样品（总共60-80个水解样品）的批次进行。对于大型项目，我们建议在每个批次中包括一个对照样品
由于静电荷的累积，处理干燥的AIR材料可能是困难的。为了将AIR移动到Sarstedt管，我们使用一次性防静电聚丙烯粉末勺（Cole-Parmer）。实验室湿度> 40％有助于减少静电
在水解期间发生的糖损失有些浓度依赖性。为了方便，制备具有等量的每种糖的标准混合物。为了更准确的绝对定量，可以根据正在分析的样品的预期组成来制备回收标准
用相同浓度的NaOH代替KOH的LC洗脱得到可比较的结果。在我们的工作中，我们使用配有KOH洗脱液发生器模块的HPAEC-PAD进行CarboPac PA-20分析。用户制备的洗脱剂通常用NaOH制备。在CarboPac PA-20手册中详细描述了洗脱液制备程序。遵循概述的程序对于避免碳酸盐进入系统是特别重要的，这极大地影响糖的色谱法

致谢

我们感谢Will Barnes（Penn州立大学）和Chris Somerville（加利福尼亚大学伯克利分校）对本协议提出有益的意见。这项工作的资金来自能源生物科学研究所和Philomathia基金会。该协议基于以下先前发布的报告：Bauer和Ibá?ez，2014; Chen 。，2016; Sorek 。，2015;和Yeats 。，2016。

参考文献

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