材料和试剂

康宁50ml锥形管（Corning，目录号：430829）
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
MACS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
MACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-501）
Raji B细胞（ATCC，目录号：CCL86）
Jurkat T细胞，克隆E6.1（ATCC，目录号：TIB-152）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14175095）
Ficoll（Tbdscience，目录号：HY2015）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（Sangon Biotech，目录号：A610185）
牛血清白蛋白（BSA）
CD4微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-045-101）
超抗原SEE（Toxin Technology，目录号：ET404）
RPMI-1640培养基（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30027.01）
热灭活的胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270-106）
抗生素 - 抗真菌溶液100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15240062）
N' - 乙基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：E1271-5G）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sangon Biotech，目录号：A600485）
抗体
抗CD3（ affymetris， eBioscience，目录号：16-0037-85） /> 抗CD28（ affymetris ，，eBioscience，目录号：16-0289-85） /> 山羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch，目录号：115-001-003）
抗Flag（Sigma-Aldrich，目录号：F3165）
抗PKC-θ（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-1875; BD，Transduction Laboratories ^{TM，目录号：610089）
抗SUMO1（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-9060）}
Tris（Sangon Biotech，目录号：A600194）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
Nonidet P40（Sangon Biotech，目录号：A600385）
抑肽酶（EMD Millipore，目录号：616370）
亮肽素（Calbiochem，目录号：108976）
苯基甲磺酰基吡咯（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
焦磷酸四钠十水合物（NaPPi）（Sigma-Aldrich，目录号：S6422）
原钒酸钠（Na 3 VO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：567540）
蛋白G琼脂糖凝胶（GE Healthcare，目录号：17-0618-01）
裂解缓冲液（见配方）

设备

血细胞计数器（Beckman Coulter，型号：Z1 COULTER COUNTER）
加湿CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Forma ^TM 3111）
层流气流生物安全柜（ESCO Micro，型号：Airstream class II）
离心机（Eppendorf，型号：5417R）

软件

ImageJ软件

程序

细胞制备和细胞培养

用500 ml HBSS稀释500 ml血液，在50ml锥形管中小心地将35 ml稀释的血液层加在15 ml Ficoll上。
在25℃，在没有制动器的摆动转子转子中以350×g离心40分钟。
吸出上层，使单核细胞层不受干扰。
小心地转移单核细胞层到一个新的50ml锥形管。用HBSS填充试管，混合，并在25℃下以300×g离心10分钟。
小心取出上清液。将细胞沉淀重悬于50ml HBSS中，并在25℃下以200×g离心15分钟。
小心取出上清液。重悬细胞沉淀在10ml含有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS中。确定细胞数量。
在25℃下以300×g离心细胞悬浮液10分钟。完全吸出上清液。
将细胞沉淀重悬于含有2mM EDTA和0.5％BSA /10μL细胞的80μlPBS中，每10 7个细胞加入20μlCD4微珠。混合并在冰箱中在4℃下孵育15分钟。
通过加入2ml含有2mM EDTA和0.5％BSA/10 7个细胞的PBS洗涤细胞，并在25℃下以300×g离心10分钟。
除去上清液并在500μl含有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS中再悬浮至10 8个细胞。然后根据CD4微珠数据表进行磁性分离以富集CD4 + T细胞，并且通过单核细胞的CD4 级分保存作为初级抗原 - （APC），其被非常低百分比的CD8 + T细胞污染但不影响以下刺激。
在补充有10％热灭活的FBS和1％抗生素 - 抗真菌溶液的RPMI-1640培养基中培养CD4 + T细胞或Jurkat T细胞，初级APC或Raji B细胞。

细胞刺激

超级抗原（SEE）刺激

在有或没有500ng/ml（初级APC）或100ng/ml（初级APCs）的情况下孵育初级APC（1×10 7个）或Raji B细胞（1×10 7个） Raji B）在1.5ml微量离心管中在37℃下在200μl终体积的RPMI-1640培养基（10％FBS）中SEE 30分钟。然后在25℃下以300×g离心细胞3分钟，并用冰冷的PBS洗涤沉淀物以获得SEE负载的APC-SEE或Raji B-SEE细胞。
用1ml冰冷PBS洗涤初级CD4 +或Jurkat T细胞（1×10 7个/孔）一次，并重悬于200μl终体积的RPMI-1640培养基中，并孵育在冰上15分钟
将APC-SEE或Raji-B-SEE与T细胞以1:1的比例（在400μl最终体积中）混合，在4℃，300×g下离心1分钟。保持细胞沉淀在培养基中，并立即孵育细胞沉淀1,5和15，30分钟，在37℃。

抗体刺激

在200μl无血清RPMI中重悬Jurkat T（1×10 7个）或人原代CD4 +细胞（1×10 7个/sup）。在冰上孵育10分钟。然后加入10μg/ml抗CD3和/或2μg/ml抗CD28单抗，将混合物置于冰上5分钟，然后用山羊抗小鼠IgG（10μg/ml）交联，并立即孵育细胞在37℃下孵育1,5,15,30分钟。

在350×g离心细胞3分钟，小心地除去上清液，并在120μl裂解缓冲液（Xie等人，2013）中裂解刺激的细胞，其含有20mM （NEM）在冰上10分钟。
通过离心（8,500×10g，10分钟，4℃）清除裂解物，然后向上清液中加入1％SDS（v/v），并通过在90℃加热10分钟解离免疫沉淀的蛋白质min。
用裂解缓冲液将步骤4中获得的裂解物稀释10倍，并用抗Flag M2或山羊抗PKC-θAbs分别在4℃下用旋转过夜免疫沉淀Flag标记的PKC-θ或内源性PKC-θ过夜。抗IgG免疫沉淀和来自未刺激细胞裂解物的IPs平行进行作为阴性对照。然后加入30μl蛋白G珠（50％[v/v]的PBS溶液），并在4°C下旋转孵育2-4小时。
在4℃下以8,000×g离心5分钟，小心除去上清液，通过加入1ml含有20mM NEM的裂解缓冲液并涡旋3-5分钟，彻底洗涤免疫沉淀物。
重复洗涤步骤另外4次。然后将样品进行SDS-PAGE，并用抗SUMO1（1：1,000）或小鼠抗PKC-θ（1：1,000）Abs进行免疫印迹。典型的免疫印迹显示在代表数据部分（图5）。

数据分析

为了排除由抗SUMO1抗体检测的非特异性条带，包括来自未刺激细胞裂解物的抗IgG免疫沉淀物（IP）和IP的一组阴性对照应包括在试验实验中。如果控制通道的信号几乎检测不到并且细胞刺激成功，则系统工作。

使用ImageJ软件分析信号如下：
点击"文件"和"打开"，然后选择图像。
点击"矩形"工具，出现一个带黄线的框。在信号周围拖动以定义要分析的区域。单击"Ctrl + 1"选择第一行（图1）。

图1. ImageJ 中的PKC-θ的sumoylated带的选择
使用箭头键将框移动到下一个车道，而不更改框的大小，单击"Ctrl + 2"选择下一个车道。重复此步骤直到选择所有通道。
用箭头键移动框到空白区域，点击"Ctrl + 2"选择背景
点击"Ctrl + 3"绘制车道。一系列图将出现在新窗口中（图2）。

图2.点击"Ctrl + 3"后的ImageJ窗口
选择"Wand工具"，然后单击每个图的区域（图3）。打开一个新窗口，其中体积数据表示定义的边界内的像素强度。从所有值中减去背景像素强度（使用空白区域的值），以获得相对强度值（图4）。

图3.选择"魔杖工具"

图4.分析后的ImageJ界面
用类似的方法定量PKC-θ印迹的信号
用其相应的PKC-θ值标准化每个泳道的SUMO1值。

代表数据

图5.人原代CD4 + T细胞中PKC-θ（PKC-θ-SUMO1）的sumoylation的体内测定。使用SEE脉冲的人APC（APC + SEE）以1:1的比例刺激分离的人原代CD4 + T细胞0-30分钟（以上泳道），通过免疫印迹分析（顶部）和没有免疫沉淀的全细胞裂解物（WCL）（底部）免疫沉淀（IP）的蛋白质（图1B），用各种分子的抗体（左边缘）探测。肌动蛋白作为加载对照（Wang等人，2015）。

笔记

由于多个SUMO附着位点，应当预期蛋白质的更大的表观分子大小。因此，推荐使用较低浓度的丙烯酰胺凝胶（，<8％）。
重要的是，细胞应该在刺激后尽可能快地裂解，因为sumoylation通常瞬时发生并且容易被SUMO特异性蛋白酶解偶联。此外，推荐在免疫沉淀过程中的裂解和洗涤步骤中在裂解缓冲液中补充20mM的N-乙基马来酰亚胺（这些蛋白酶的化学抑制剂）。
由于内源性PKC-θ的sumoylated带的信号可能非常弱，膜与抗SUMO1 Ab在4°C过夜孵育和更长的暴露时间，当可视化的免疫印迹信号强烈推荐。

食谱

裂解缓冲液
20mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 5 mM EDTA
1％Nonidet P40
10μg/ml抑肽酶
10μg/ml亮肽素 1mM PMSF
5 mM NaPPi
1mM Na 3 VO 4 sub。

致谢

该方案从体内泛素化试验中修改（Wertz等人，2004）。由中国国家自然科学基金（31170846）和中国科学技术部支持（2013CB835300）。

参考文献

Wang，XD，Gong，Y.，Chen，ZL，Gong，BN，Xie，JJ，Zhong，CQ，Wang，QL，Diao，LH，Xu，A.，Han，J.，Altman， Y.（2015）。 TCR诱导的激酶PKC-θ控制T细胞突触组织和T细胞活化。 Nat Immunol 16（11）：1195-1203。
Wertz，IE，O'Rourke，KM，Zhou，H.，Eby，M.，Aravind，L.，Seshagiri，S.，Wu，P.，Wiesmann，C.，Baker，R.，Boone，DL，Ma ，A.，Koonin，EV和Dixit，VM（2004）。 430（7000）：694-699。
Xie，JJ，Liang，JQ，Diao，LH，Altman，A.和Li，Y。（2013）。