材料和试剂

Jurkat E6.1细胞或HEK293T细胞
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
RPMI-1640培养基（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30027.01）
热灭活的胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270-106）
抗PKC-θ（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-1875）
抗-Myc（9E10）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-40）
蛋白G琼脂糖凝胶（GE Healthcare，目录号：17-0618-01）
来自PepTag 非放射性PKC测定试剂盒（Promega，目录号：V5330）的磷脂酰丝氨酸
Tris（Sangon Biotech，目录号：A600194）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sangon Biotech，目录号：A610185）
Nonidet P40（Sangon Biotech，目录号：A600385）
抑肽酶（EMD Millipore，目录号：616370）
亮肽素（Calbiochem，目录号：108976）
苯基甲磺酰基吡咯（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
焦磷酸四钠十水合物（NaPPi）（Sigma-Aldrich，目录号：S6422）
原钒酸钠（Na 3 VO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：567540）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11344041）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M4880）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
[γ-32 P] ATP（PerkinElmer，目录号：NEG002Z001MC）
髓磷脂碱性蛋白（MBP）（Sigma-Aldrich，目录号：M1891）
PMA（Sigma-Aldrich，目录号：P1585）
溴酚蓝（Bio-Rad，目录号：1610404）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
甘油（Sangon Biotech，目录号：A100854）
ATP竞争性PKC-θ抑制剂rottlerin（EMD Millipore，目录号：557370）
DMSO
裂解缓冲液（见配方）
PKC-θ激酶缓冲液（参见配方）
反应缓冲液（参见配方）
5x SDS-PAGE上样缓冲液（见配方）

设备

Typhoon Trio ⁺系统（GE Healthcare）
加湿CO 2培养箱
层流气流生物安全柜
离心机（Eppendorf，型号：5417R）
荧光屏（GE Healthcare）
超声波仪（Sonics，型号：VCX-130）
热固机（Eppendorf）
曝光盒（GE Healthcare）

软件

台风扫描仪控制软件

程序

收获5×10 6个用载体，野生型（WT），激酶失活突变体（K409R）和苏氨酰化转染的Jurkat E6.1细胞或1×10 6个HEK293T细胞通过离心（300×g，3分钟，25℃）分离Myc-PKC-θ（图2所示）的缺陷型突变体（2KR [K325R，K506R]）。
用1ml冰冷的PBS洗涤细胞一次。
在25℃下以300×g离心细胞3分钟。
向细胞沉淀中加入300-500μl裂解缓冲液，涡旋1-2分钟
将管在冰上放置10分钟。
在4℃下以8,500×g离心10分钟。
将清澈的上清液转移到新的微量离心管中
通过向步骤7中获得的澄清上清液中加入2.5μl抗PKC-θ或抗Myc抗体来免疫沉淀内源性或转染的PKC-θ。在4℃下旋转过夜孵育。然后加入30μl蛋白G琼脂糖珠（50％[v/v]的PBS溶液），并在4℃下旋转孵育2-4小时。
在4℃下以8,500×g离心5分钟，小心地除去上清液。通过加入1ml裂解缓冲液并涡旋3-5分钟来广泛洗涤免疫沉淀物
重复步骤9.
在4℃下以8,500×g离心5分钟，小心地除去上清液。通过加入1ml PKC-θ激酶缓冲液并涡旋3-5分钟来广泛地洗涤免疫沉淀物。
重复步骤11.
在4℃下以8,500×g离心5分钟，小心地除去上清液并将沉淀重悬于25μl反应缓冲液中。
孵育样品在Thermomixer中轻轻摇动300 rpm在30℃30分钟。通过加入6.25μl5x SDS-PAGE上样缓冲液停止反应。
在95℃下加热样品10分钟，并将样品进行15％SDS-PAGE，然后用塑料包膜覆盖凝胶，以最小化放射性污染的机会。
打开曝光盒，将包裹的凝胶放置在盒的内表面上，然后将荧光粉存储屏放置在包裹的凝胶上，使荧光体（白色）面朝下到凝胶上。关闭并锁定磁带，将其在室温下放置30分钟至6小时，然后将荧光粉存储屏幕从磁带盒中取出，避免直接照明。使用Typhoon Trio ⁺系统扫描屏幕。
（可选）建议进行试验性实验以验证该激酶测定的特异性。详细地，用已经证明是活性激酶的野生型Myc-PKC-θ转染HEK293T细胞，因为T538，S676和S695在从HEK293T表达系统分离的重组PKC-θ上组成型磷酸化（Wang等人al 。，2012）。转染后24小时，Myc-PKC-θ免疫沉淀，并如前所述进行激酶测定。当进行激酶测定时，将ATP竞争性PKC-θ抑制剂或DMSO加入到单独作为阴性和阳性对照的反应缓冲液中。

数据分析

如果对于加入的DMSO样品存在强信号，则激酶测定系统具体工作，而在试验实验中没有PKC-θ抑制剂样品的信号。
用Typhoon Scanner Control软件分析信号如下：

双击桌面上的"扫描仪控制"快捷方式图标。
当前仪器状态为"Ready"后，选择采集模式为"存储荧光粉"（图1）。

图1.扫描仪控制窗口
将存储荧光屏放在Typhoon仪器中。从曝光盒上取下存储荧光屏。保持屏幕正面朝下。将屏幕放置在玻璃压板上，使屏幕的A1角与玻璃压板的A1角对齐。关闭样品盖。
选择网格区域和像素大小，单击"扫描"开始扫描。
保存数据并评估结果。来自转染的HEK293T细胞的样品的代表性数据显示于图2中。

代表数据

图2. Myc标记的PKC-θ的体外激酶测定。 Myc-PKC-θ-WT，-2KR（K325R，K506R）或-K409R免疫沉淀IP）从用空载体或指定的Myc标记的PKC-θ质粒转染的HEK293T细胞的裂解物中，在PtdSer/PMA辅因子（上图）存在下，MBP用作底物。用抗-Myc免疫印迹IP的等分试样以确认PKC-θ的类似表达水平（下图）。

笔记

磷脂酰丝氨酸容易聚集形成胶束。为了实现最大PKC-θ活化，用探针超声波仪超声处理磷脂酰丝氨酸溶液20-30秒或直到温热以破坏胶束。

食谱

裂解缓冲液
20mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 5 mM EDTA
1％Nonidet P40
10μg/ml抑肽酶
10μg/ml亮肽素 1mM PMSF
5 mM NaPPi
1mM Na 3 VO 4 sub。
PKC-θ激酶缓冲液
20 mM HEPES
10mM MgCl 2/
0.1 mM EGTA
反应缓冲液
5μCi[γ-32 P] ATP，20μMATP 1μg髓磷脂碱性蛋白（MBP）
10μMPMA辅因子
200μg/ml磷脂酰丝氨酸（PtdSer）（存在或不存在）
5x SDS-PAGE上样缓冲液
0.25％溴酚蓝
0.5 M DTT
50％甘油 10％SDS
0.25M Tris-HCl（pH 6.8）

致谢

由中国国家自然科学基金（31170846）和中国科学技术部支持（2013CB835300）。该方案从体外激酶测定（Bi，2001）修改。

参考文献

Bi，K.，Tanaka，Y.，Coudronniere，N.，Sugie，K.，Hong，S.，van Stipdonk，MJ and Altman，A。（2001）。抗原诱导的PKC-θ向膜筏的易位是T细胞活化所必需的。 > Nat Immunol 2（6）：556-563
（a，b，c，c，d，c，d，c，d，c，d，d） "ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21983831"target ="_ blank">激酶GLK通过激活激酶PKC-θ来控制自身免疫和NF-κB信号传导T cells。 Nat Immunol 12（11）：1113-1118。
Isakov，N。和Altman，A。（2012）。 PKC-θ介导的来自TCR/CD28表面受体的信号传递。前免疫 3：273.
在这种情况下，我们可以使用一个简单的例子来说明这个问题，即：激酶PKC-θ的V3结构域中的基序通过与CD28的结合确定其在免疫突触中的定位和在T细胞中的功能。 Nat Immunol 12（11）：1105-1112。
Monks，CR，Kupfer，H.，Tamir，I.，Barlow，A.和Kupfer，A。（1997）。蛋白激酶C和脂质信号传导持续的细胞反应。 FASEB J 9（7）：484-496。
Rosse，C.，Linch，M.，Kermorgant，S.，Cameron，AJ，Boeckeler，K.and Parker，PJ（2010）。
Wang，X.，Chuang，HC，Li，JP和Tan，TH（2012）。