材料和试剂

96孔透明平底聚苯乙烯组织培养板（Corning，目录号：3596）
384孔透明平底聚苯乙烯组织培养板（Corning，目录号：3701）
96孔PCR板（Corning，Axygen ，目录号：PCR-96-FS-C）
100mm组织培养板（Corning，目录号：430167）
1.5ml Eppendorf管（VWR，目录号：89000-028）
15ml Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352097）
移液管吸头（Mettler-Toledo International，目录号：RT-L10FLR）
移液管吸头（Mettler-Toledo International，目录号：RT-L200F）
移液管吸头（Mettler-Toledo International，目录号：RT-L1000F）
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：8245）的移液管吸头
Matrix（125μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：7445）
感兴趣的粘附细胞系
适当的培养基
试剂库无菌（Corning，Costar ，目录号：4870）
试剂库无菌（VWR，目录号：89094-684）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）或无血清培养基（SFM，添加胎牛血清前的适当培养基）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（GE Healthcare，目录号：SH30256）
胰蛋白酶溶液（2.5％，wt/vol）（GE Healthcare，目录号：SH30042.01）
将致死性牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T9154）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：91228）
在1％（vol/vol）乙酸中的磺酰罗丹明B钠盐（SRB）（Sigma-Aldrich，目录号：S1402）
乙酸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S25118）
10mM无缓冲的Tris碱溶液（Sigma-Aldrich）
DNAse/RNAse游离水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM9932）}
Lipofectamine RNAimax（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：13778150）
Mirvana miRNA mimics（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM）
miRNA前体分子 - 阴性对照＃2（非靶向scramble miRNA）（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM17111）

设备

移液器（Mettler-Toledo International，目录号：L-1000XLS）
移液管（Mettler-Toledo International，目录号：L200-XLS）
移液管（Mettler-Toledo International，目录号：L20-XLS）
移液管（Mettler-Toledo International，目录号：L2-XLS）
多通道移液管（Mettler-Toledo International，目录号：L12-200XLS）
多通道移液管（Mettler-Toledo International，目录号：L12-20XLS）
Matrix 多通道电子移液管（384孔格式）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2011）
Matrix 多通道电子移液管（96孔格式）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2004）
CO 2 sub孵化器（Panasonic Biomedical Sales Europe，型号：MCO-230AIC-UV）
倒置显微镜（尼康，型号：TS100）
多孔微板读数器（Glomax，Promega）
血细胞计数器（Hausser Scientific，Bright-Line ^TM，目录号：1492）

软件

统计分析软件（GraphPad Prism，SPSS）

程序

处理溶液制备
1. 选择的治疗体积应足以在96孔板中一式三份（每个重复50μl;孔100μl中的最终体积）或384孔板中的6个重复（每个重复10μl;孔20μl的终体积）也说明移液变化。
2. 可以在水溶液（用于转染的Opti-MEM）或所选择的溶剂（例如DMSO）中制备处理。
细胞制备
1. 从细胞单层去除培养基，用无菌PBS洗涤细胞一次
2. 除去PBS，加入1ml（100mm板）0.25％（wt/vol）胰蛋白酶以均匀覆盖细胞生长表面。
3. 在37℃孵育5分钟或直到细胞开始解离。
4. 接下来用10体积的含有FBS的培养基使胰蛋白酶失活，并且上下混合以获得均匀的单细胞悬浮液。
5. 将细胞悬液转移到无菌Falcon管。通过在显微镜下使用细胞悬浮液和0.4％（wt/vol）台盼蓝溶液的1:1混合物在血细胞计数器室中计数来确定细胞浓度，以确定细胞接种前的细胞活力。可选：在计数前，旋转细胞以洗涤胰蛋白酶并重悬于生长培养基中。
  注意：如果通过检查台盼蓝染色（图1），溶液中的细胞看起来健康，则只需进行后续步骤。
  
  图1.人支气管上皮细胞（HBEC）的台盼蓝染色。箭头指向有色细胞，表明细胞死亡。在它下面的活细胞，具有完整的膜，因此不着色
6. 用生长培养基（10％FBS）调节细胞浓度，以50μl（96孔板）或10μl（384孔板）的体积每孔获得合适的细胞接种密度。
  注意：初始细胞接种密度将取决于两个主要因素：1）所用细胞系的倍增时间和2）板将被读取的那天。细胞通常在70-80％汇合（对于96-孔形式为2×10 4个，对于384-孔形式为8×10 3个），在实验结束时（第5天）。
7. 将细胞悬液转移到无菌试剂池，以便更容易用多通道移液器移液
治疗风险
1. 通过吸移混合步骤A中制备的处理溶液。在每个孔中加入50μl（96孔板）或10μl（384孔板）溶液
2. 彻底混合步骤B中制备的细胞悬液，并向已经含有处理溶液的每个孔中加入50μl（96-孔形式）或10μl（384-孔形式）。
  注意：确保平板细胞均匀分布在平板底部，避免摇动平板以避免"环效应"。实现这一点的最佳方法是将细胞溶液直接添加到孔底部，避免接触壁。我们还建议在将板置于培养箱中之前进行短旋转（20秒，10 x g）。
3. 将仅含有Opti-MEM或选择的溶剂的板中的三个孔，以及用于未处理或载体对照的细胞悬浮液。另外，在仅含有用于背景扣除的培养基的平板中留下三个孔。
4. 在37℃下在具有5％CO 2的潮湿培养箱中孵育该平板，直到读取平板。
  注意：孵育时间将取决于被测试化合物的类型，并且必须通过实验确定。例如，在我们的手中，在转染后5天，观察到阴性对照和肿瘤抑制性miRNA之间细胞增殖的最大差异。
细胞固定和染色
1. 轻轻地添加25微升（96孔格式）或5微升（384孔格式）冷50％（重量/体积）TCA到每个孔直接到培养基上清液，并在4°C孵育板1小时。不需要混合，因为这可能导致一些细胞从孔底部分离通过将板浸入带有慢速自来水的桶中来洗涤板四次，并通过轻轻地将板轻拍到纸巾中来去除过量的水。最后一次洗涤后，将板在室温下风干注意：如果水被迫进入孔，则可能发生细胞单层脱离。我们建议让板完全干燥，然后继续下一步。如果需要，干燥的板可以无限期地在室温下储存。
2. 向每个孔中加入50μl（96-孔形式）或20μl（384-孔形式）的0.04％（wt/vol）SRB溶液。
  注意：确保溶液与孔底部直接接触，并且两者之间没有气泡。 SRB溶液不是光敏感的，因此在孵育期间不需要覆盖板。
3. 在室温下放置1小时，然后用1％（体积/体积）乙酸（200μl用于96孔板或30μl用于384孔板）快速冲洗板4次以除去未结合的染料。使板在室温下风干。
  注意：非均匀洗涤是该测定中的主要误差来源。必须快速和均匀地在整个板上进行洗涤。这对384孔格式特别重要。孔的小面积导致高的表面张力，有时使得难以均匀地洗涤板。目视检查板中的所有孔已注入1％（vol/vol）乙酸，并且没有气泡防止洗涤。我们建议用多通道移液器洗涤，并使用孔壁将溶液间接注入孔中。
吸光度测量
1. 向每个孔中加入50μl至100μl的10mM Tris碱溶液（pH 10.5），并在轨道摇床上摇动板10分钟以溶解结合蛋白的染料（约10分钟）。
2. 在酶标仪上测量510 nm处的吸光度。

数据分析

减去所有孔的背景吸光度。使用下式计算细胞生长抑制归一化处理对miRNA阴性对照的百分比：
％细胞生长=吸光度样品/吸光度阴性对照或未处理×100（图2B）％生长抑制= 100％细胞生长
SRB测定结果只能在数据落入测定的线性限度内时使用。我们建议进行细胞数滴定实验以确定使用细胞系的测定的线性动态范围（图2A）。一般来说，O.D.的> 2不在测定的线性范围内这种类型的测定的统计学测试可以包括用于两组比较的试验或用于多组比较的ANOVA。< br /

图2.细胞培养物中的磺酰罗丹明B比色测定以分析细胞增殖。A.使用SRB测定384孔格式的细胞数滴定（H441），n = 6，误差条= SD。 B.使用SRB 96孔形式的肺癌细胞系H441和H358中的miR-34a剂量反应分析，n = 3。

笔记

根据我们的经验，使用多通道电子移液器384孔格式化验可减少由于移液误差引起的变化。为此，强烈建议在96孔PCR板中制备miRNA-脂质体复合物，这将允许使用多通道移液器。
接种密度将取决于待使用的细胞系的倍增时间以及读出的天数。作为经验法则，不应允许细胞在读出当天达到100％汇合。根据我们的经验，80％的最终融合提供了非小细胞肺癌细胞系（例如H441，A549，EKVX）的令人满意的结果。
治疗后的固定日也必须凭经验确定。根据我们的经验，转染miRNA模拟物后4-6天在非小细胞肺癌细胞系中提供令人满意的结果，与对照相比显示最大的生长抑制。
对于miRNA转染：

可以在无血清/抗生素的培养基中制备MiRNA-脂质体复合物。
对于要使用的每种细胞系，必须凭经验确定Lipofectamine RNAimax的量，以鉴定提供最大转染效率和最小细胞毒性的试剂的量。这消除了在转染后改变培养基的需要，这是这些类型的测定的常见变化来源。
在我们的手中，我们确定在面板中0.12μl（对于96-孔塑料-100μl）或0.05μl（对于96-孔板 - 20μl）的Lipofectamine RNAimax足以转染6nM的miRNA模拟物而毒性最小的非小细胞肺癌细胞。每个转染应在同一板中复制（我们建议在96孔板中至少重复3次，或在384孔板中至少重复3次）。
根据我们的经验，逆转染减少了测定的时间，同时减少了转染，洗涤步骤和在转染后更换Opti-MEM后培养基更换期间的变异来源。

致谢

本文提供的方案改编自Kasinski等人。（2015）。这项工作得到了NIH资助（R00CA178091和P30CA023168）的支持。

参考文献

Kasinski，AL，Kelnar，K.，Stahlhut，C.，Orellana，E.，Zhao，J.，Shimer，E.，Dysart，S.，Chen，X.，Bader，AGand Slack，FJ（2015）。抑制非小细胞肺的组合microRNA治疗方法癌症癌基因 34（27）：3547-3555
Skehan，P.，Storeng，R.，Scudiero，D.，Monks，A.，McMahon，J.，Vistica，D.，Warren，JT，Bokesch，H.，Kenney，。抗癌药物筛选的新的比色细胞毒性测定。/a> J Natl Cancer Inst 82（13）：1107-1112
Vichai，V.和Kirtikara，K。（2006）。 Sulforhodamine B比色法测定细胞毒性筛选。 Nat Protoc 1（3）：1112-1116。