材料和试剂

材料
1. Miracloth
2. 将30ml Nalgene TM高速聚碳酸酯离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，目录号：3118-0030）（或等价物）离心该植物提取物br />
3. 5ml聚丙烯薄壁超速离心管（Beckman Coulter，目录号：326819）
4. 10ml超速离心机，带有等密封盖的14×89mm管（BioComp Instruments，目录号：105-914A）
5. 细规格
6. 10毫升注射器
7. 要连接到注射器上的插管（Thomas Scientific，目录号：1193G13）
8. 预灭菌，无RNase的5ml，1ml，200μl和10μl微量吸头
9. 预灭菌，无RNA酶的2ml和1.5ml微量离心管
10. 15和50ml Falcon管
11. 塞子固定1.5毫升管的盖子
12. 剃刀刀片
13. Dynabeads mRNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：610-06）
14. 2 ml微量离心管
15. 1.5ml不粘的，无RNA酶的微管（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ，目录号：AM12450）
16. Myone TM链霉亲和素C1 DynaBeads （Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：65601）
17. 200μlPCR条带管
试剂
1. 液氮
2. 无RNase，无菌，MilliQ水
3. Tris碱
4. 蔗糖
5. 氯化钾（KCl）
6. 氯化钠（NaCl）
7. 氯化镁（MgCl 2）
8. 乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N-四乙酸（EGTA）
9. 乙二胺四乙酸（EDTA）
10. 二硫苏糖醇（DTT）
11. Brij-35 [聚氧乙烯（23）月桂基醚]
12. Triton X-100
13. Igepal CA 630（辛基苯基 - 聚乙二醇）
14. 吐温20（聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯20）
15. 环己酰亚胺（见注1）
16. 氯霉素（见注1）
17. 氯化锂（LiCl）
18. 乙酸钠（NaOAc）
19. 碳酸氢钠（NaHCO 3）
20. 碳酸钠（Na 2 CO 3）
21. 十二烷基硫酸钠（SDS）
22. 氢氧化钠（NaOH）
23. 柠檬酸三钠（Na 3+，6+，H 5 O，7）
24. 二甲基亚砜（DMSO），PCR级
25. 乙醇，分子生物学等级
26. 水饱和，酸性苯酚，分子生物学等级（见注2）
27. 氯仿，分子生物学级（见注2）
28. 异戊醇
29. 异丙醇，分子生物学等级
30. PEG8000
31. 15mg/ml GlycoBlue （Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：AM9515）
32. 10 bp DNA ladder（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10821015）
33. 2x染色的变性样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：LC6876）（参见注释3）
34. SYBR Gold，在DMSO中10,000x（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：S11494）（参见注释4）
35. dNTP混合物，10mM（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：18427-013）}
36. OmniPur聚乙二醇8000（EMD Millipore，Calbiochem ，目录号：6510）
37. 通用miRNA克隆接头（New England Biolabs，目录号：S1315S）
38. 硼酸
39. 乙酸
40. 12孔15％聚丙烯酰胺TBE-脲凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：4566055）（参见注释5）
41. 30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0156）（见注5）
42. 过硫酸铵（APS）
43. TEMED（N，N，N'，N'-四甲基乙烷-1,2-二胺）（Sigma-Aldrich，目录号：T7024）
44. 甘油
45. 溴酚蓝
酶
1. SUPERase-In RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM2694）
2. TURBO TM DNA酶（2U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM2238）
3. RNA酶I（100U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：AM2294）
4. SuperScript III逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18080-093）
5. T4多核苷酸激酶，T4 PNK4（New England Biolabs，目录号：M0201），提供有10×T4 PNK缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0201）（参见注释6）
6. T4 RNA连接酶2，截短（New England Biolabs，目录号：M0242），其提供有PEG 8000 50％和10×T4 Rn12缓冲液
7. Phusion高保真DNA聚合酶（2U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：F-530S）
8. CircLigase TM sup/ssDNA连接酶（100U /μl）（Epicentre，目录号：CL4115K）
寡核苷酸
1. 用于分离衔接子环化的逆转录引物（参见注释7）
  NI-NI-9：[P] AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC [SC18] CACTCA [SC18] TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG（Ingolia等人，2009）
2. 尺寸标记寡核苷酸（Ingolia等人，2009）（参见注释8）
  oNTI265：rArUrGrUrArCrArCrGrGrArGrUrCrGrArGrCrUrCrArArCrCrCrGrCrArArCrGrCrGrA
  oNTI268：rArUrGrUrArCrArCrGrGrArGrArCrCrCrGrCrArArCrGrCrGrA
3. rRNA减除寡核苷酸（这里所有的寡核苷酸都具有5'TEG连接的生物素，并且从IDT获得）。这些寡核苷酸基于使用3日龄拟南芥发现的最丰富的rRNA序列和转座子， em>幼苗和本文所述的核糖体印迹协议（参见注释9） rRNABio1：5'-gataaccgtagtaattctagag-3'
  rRNABio2& 4：5'-TGATTCATGATAACTCGACGGACGACGCGGATTACGGTGGCGGC-3'
  rRNABio5& 3：5'-GTCGCTGCCGTGATCGTGGTCTCCATCGAGTCTTTGAACGCAAG-3'
  生物展示：5'-GAGGGATGCAACACGAGGAGTTCCCGGGAGGTCA-3'
  Bio-5S：5'-AAGCCTTCTGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACAA-3'
  Bio-18S：5'-AAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTG-3'
4. 扩增引物
  NI-NI-2：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'（Ingolia等人，2009）
  NI-NI-3：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'（Ingolia et al。，2009）
  备选索引引物
  索引1：
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'
  索引2：
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'
  索引3：
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'
  索引4：
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'
  索引5：
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'
  索引6：
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'
  索引7：
  5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3'
解决方案
所有溶液应使用无RNase，MilliQ水制备。除非另有说明，所有这些产品必须通过高压灭菌至少20分钟，并在室温下储存
1. 1 M Tris-HCl，pH 7.0（见注10）
2. 1 M Tris-HCl，pH 8.0（见注10）
3. 1 M Tris-HCl，pH 9.0（见注10）
4. 1M蔗糖，由分子生物学级蔗糖制备（高压灭菌10分钟）
5. 1 M KCl
6. 5 M NaCl
7. 1 M MgCl 2
8. 0.5 M EGTA，pH 8.0（参见注释11）
9. 0.5 M EDTA，pH 8.0（见注释11）
10. 2mM EDTA，100mM Na 2 CO 3 Sub Sub
11. 2mM EDTA，100mM NaHCO 3/v/v
12. 3 M NaOAc，pH 5.5
13. 10％SDS（w/v）
14. 1M NaOH（无需灭菌）
15. 4 M LiCl（过滤灭菌，不高压灭菌）
16. 1 M DTT（不要高压灭菌;等分并储存在-20℃）
17. 100mg/ml环己酰亚胺，在DMSO中制备（过滤灭菌;等分并储存在-20℃）
18. 50mg/ml氯霉素，在乙醇中制备（过滤灭菌;等分并储存在-20℃）
19. 洗涤剂混合物中的四种洗涤剂（Brij-35，Triton X-100，Igepal CA 630和Tween 20）中的每一种的20％（w/v或v /
20. 50％PEG8000（w/v），通过将干PEG与水在50ml锥形中混合并轻轻振荡混合过夜制备。不需要灭菌。 PEG非常吸湿;因此开始添加PEG至少于MilliQ水的最终体积的一半。然后，溶解后，如果需要，加入更多的水。用于结扎的PEG（步骤C3）不应超过1个月大
21. 10％APS（w/v），过滤灭菌并小份等分（例如，500μl）。储存于-20°C。等分试样可以解冻并重新冷冻几次。
缓冲区（参见配方）
1. 多聚体提取缓冲液（PEB）
2. 蔗糖垫A（SCA）
3. 蔗糖梯度解决方案
4. 多聚体消化缓冲液（PDB）
5. 蔗糖垫B（SCB）
6. Polysome重悬浮缓冲液（PRB）
7. 总RNA提取缓冲液（TREB）
8. 碱性片段缓冲液（2x）
9. 碱性碎裂停止/沉淀溶液
10. TAE（Tris /乙酸盐/EDTA缓冲液）（50x）
11. TBE（Tris /硼酸盐/EDTA缓冲液）缓冲液（5x）
12. RNA凝胶提取缓冲液（GEB）
13. DNA凝胶提取缓冲液（STE）
14. SSC（20x）
15. 减法结合/洗涤缓冲液（2x）
16. 8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶（12ml）
17. 非变性负载染料（6x）

设备

7-9厘米直径的陶瓷砂浆和杵
小（30-50 ml）玻璃烧杯
冷冻Beckman Avanty J-25离心机和Beckman JA17转子（或同等品）
使用具有用于多核糖体制粒（Beckman Coulter，型号：SW55Ti）和蔗糖梯度离心（Beckman Coulter，型号：SW41Ti或Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific）的摇摆桶转子的超速离心机Beckman L8-70M（或等同物），型号：TH-641）
自动P1000，P200和P10微量移液器
制冷台式微量离心机
轨道振动器
梯度主站，使用梯度制备器和分馏站（BioComp Instruments）
连续UV光监测器（Bio-Rad Laboratories，型号：EM-1 Econo UV监测器）
分馏器（Gilson，型号：FC203B）
Nanodrop（或另一个分光光度计，用于定量小体积RNA中的核酸浓度）
营养振动器
热块
通风橱
Mini-PROTEAN四细胞聚丙烯酰胺凝胶盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-8004）或等同物和电泳电源
紫外透射仪
涡流
DynaMag ^TM -2磁性分离架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
温度计
2100 BioAnalyzer（Agilent Technologies，目录号：G2940CA）
HiSeq2000（Illumina）

程序

湿实验室方案分为A，B和C步骤（参见图1的概述）。关于制备核糖体印迹的步骤。 B步骤是指总mRNA分离程序。 C步骤代表方案的部分，其中将足迹和mRNA片段一起加工以产生测序文库。执行A和B步骤的顺序取决于研究者。
组织需要在所需的处理后快速冷冻，在液氮中研磨成非常细的粉末，然后在-80℃下储存直至使用。 0.5μg的这种粉碎的组织是核糖体印迹所需的，并且需要0.5-1g来制备mRNA片段。优良作法是首先分离多核糖体而不包括消化步骤以确保在进行覆盖库的制备之前分离完整的多核糖体。与所有RNA协议一样，在任何时候不应该允许组织在没有缓冲液的情况下解冻，并且所有材料和溶液需要不含RNA酶。除非另有说明，所有的工作都应在冰上进行。
这些协议允许在9天内从冷冻的地面组织产生准备好的Ribo-seq和RNA-seq文库。整个协议是在工作日组织的。在方案结束时，我们包括一个数据分析部分，其描述了通过治疗或突变而导致翻译水平调节的基因的鉴定的管道。

图1.核糖体足迹程序概述。A.蓝色面板：核糖体足迹特异性步骤; B.绿色面板：特异于mRNA文库制备的步骤; C.黄色面板：两种类型的库都通用的步骤。 A，B和C步骤也在书面协议中标记。

步骤：核糖体足迹
图2示出了包括A步骤的过程的流程图

图2.协议的A步骤概述

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数据分析

本文描述的使用核糖体印迹数据研究翻译调节的生物信息学分析遵循Merchante等人描述的管道。（2015）。该管道的输入是来自Illumina HiSeq2000平台的解复用Ribo-seq和RNA-seq数据集（fastq文件），TAIR 10拟南芥基因组序列和TAIR 10拟南芥基因模型（ https://www.arabidopsis.org/）。

一般数据预处理
1. 使用FASTX工具包（ http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/），删除衔接头序列和修剪低质量区域
2. 使用Tophat2（ https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml ）。
3. 选择唯一映射，大小范围为20-40 nt的感应方向读取，丢弃具有两个以上不匹配的对齐，并创建编码（CDS）区域的读取计数摘要。
质量控制周期的评估
核糖体足迹，但不是RNA-seq读数，应该显示强的3nt周期性，其代表密码子长的逐步核糖体沿mRNA的运动（Ingolia等人，2009; Merchante等人， 2015）。所以，这种周期性的存在可以用作控制质量的足迹。为了避免边缘效应，限制分析具有长于70nt的5'和3'UTR的基因和长于150nt的CDS。至避免关于沿着转录物的读取位置的模糊性，将分析限制为固定长度的读取 - 通常为28至之间的值 32 nt，通过视觉检查（C1步骤）确定 - 在意义上的映射方向只有一个抄本。
1. 将基因组阅读坐标转换为转录本坐标
2. 可视化CDS开始：项目附近的读取分布选择的读取到"metagene"的公共坐标系。使用它们相对于主开放阅读框的开始的相对位置来对读取起始点的转录物坐标进行二进制化：在CDS的开始处开始的读取落入bin'0'。为了可视化CDS末端周围的读取分布，以类似的方式进行，但是相对于主开放阅读框的末尾处理。
3. 通过所选读取的总数来标准化读取开始位置的直方图，并绘制一个围绕bin'0'的区域
差异性转录和翻译的边缘分析
1. 丢弃具有小读数的基因（任何样品中rpkm值小于3），并执行TMM标准化（Robinson和Oshlack，2010）。
2. 通过2-因子设计建模实验，其中因子1是例如乙烯/对照处理，因子2是RNA-seq/Ribo-seq处理。使用Bioconductor package edgeR（Robinson等人，2010）的广义线性模型方法（glm edgeR）选择在该实例中i）在RNA水平上响应乙烯的基因，ii ）在足迹水平上响应乙烯，以及iii）在RNA水平和足迹水平上对乙烯的响应不同。使用Benjamini和Hochberg的方法（Benjamini和Hochberg，1995）确定假发现率。
分析变化翻译效率
1. 根据Ingolia及其同事的定义（Ingolia等人，2009），将计算翻译效率（TE）作为Ribo-seq足迹rpkm值相对于RNA-seq rpkm值的分数：TE = rpkm脚）/rpkm（mRNA）
2. 计算乙烯处理的植物的log 2变换的TE值，并减去相应的对照值：ΔTE= log 2（TE亚乙基）-log ₂（TE _control）
3. 计算ΔTE的z分数：zΔTE=（ΔTE-E [ΔTE]）/√Var（ΔTE）。使用R包fdrtool确定错误发现率（Strimmer，2008）。

笔记

环己酰亚胺和氯霉素毒性很大，对环境有害
苯酚和氯仿均为急性毒素。在通风橱中对其进行处理，并采取适当的保护措施。
具有染料的2x变性样品缓冲液含有甲酰胺，其是生殖毒素。在处理时应采取适当的保护措施。
核酸污渍通常是致突变的，在处理它们时使用适当的保护
丙烯酰胺和双丙烯酰胺都是神经毒素，在处理它们时使用适当的保护
确保不要与T4多核苷酸激酶3'磷酸酶减（M0236）混淆正确的T4 PNK（M0201），后一种情况下，连接步骤将不起作用。
[P]表示5'-磷酸化，[SC18]表示六乙二醇间隔基
'r'表示这些是RNA寡核苷酸
如果使用不同的处理，生长条件，发育阶段，足迹协议等，这些寡核苷酸可能需要重新设计。
该方案需要在pH7.5,7.8,8.0,8.4,8.8和9.0的Tris-HCl，但是所有中间浓度的Tris-HCl缓冲液可以从这里列出的Tris-HCl pH7.0,8.0和9.0制备。
EGTA和EDTA仅在调节pH后溶解
由于使用洗涤剂，会有泡沫。确保收集所有的气泡。
当制备等分试样时，允许一些过量，因为溶液非常粘稠。对于两个样品，1.2ml等分试样工作良好
SW55Ti转子允许同时旋转6个样品，因此每次离心一轮最多需要3ml SCA。
例如5ml超速离心管或15ml Falcon管
该步骤是必要的，因为如果上清液在旋转结束时没有快速转移到不同的管中，则碎屑小球可以容易地脱落;未能立即转移上清液将导致碎屑的携带并损害超速离心
蔗糖梯度也可以在单体造粒离心机 - 步骤A2.7制备
大约一半的管。
如果使用光合组织，多核糖体丸将是清澈的，如果使用光合组织，则是深绿色
如果有一个控制管不会被消化，不要加RNase I到它，并保持在冰上，直到消化时间结束。
执行此操作时请格外小心，以免干扰渐变。
如果使用1.5 ml管加热苯酚：氯仿，不要让温度高于65°C并固定盖子，因为由于压力，盖子可以很容易打开并产生危险的溢出，导致损失了珍贵的样品
单独的苯酚也可以用于提取RNA，但是如果是这种情况，水相可以是较低的，因为提取物中高浓度的蔗糖。
也可以使用与高通量测序文库构建和下一代测序兼容的其他标准RNA提取方法（例如，Trizol）。
苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）也可以使用
也可以使用Beckman Avanty J-25中的JA17管
如果使用2ml离心管，加入500μl提取物到不同的微管预先填充50μl3 M乙酸钠pH 5.2，混合和添加1375微升乙醇。
34,895 x g 如果使用Beckman离心机
在此步骤中，如果需要，样品可以在4℃下放置过夜
停止溶液已含有300mM盐，因此不需要更多的盐来沉淀RNA
如果样品被寡核苷酸包围，则更容易选择大小，因此，在凝胶的开始和结束处运行两个寡聚体泳道。
运行的时间必须根据运行的单元根据经验确定。使用引物开始运行测试是一个好的做法。作为参考，对于第一次运行不让来自变性样品缓冲液的下蓝色带跑出凝胶。注意标记引物相对于染料的位置，并调整未来运行时间以进行引物测试
凝胶块不破碎或改变外观。
允许相对较高的过量，因为混合物非常粘稠，难以移液
如果室温孵育后在4℃过夜孵育，连接效率增加
作为参考，连接的样品通常在样品缓冲液的较高蓝色带上方运行
当引物以大量过量存在时，来自未延伸引物的背景增加，其在一些情况下可支配实际文库产物。最好根据经验确定正确的比例。 1-2μl1.25μM的NI-NI-9引物应该正常工作。这可以在凝胶运行后测试：未延伸的引物在RT步骤后仍然存在，但是扩展文库不应比引物本身更暗。
将环化的文库重悬于20μl中，仅10μl用于减去杂交步骤。将剩余的10μl保持在-80°C作为备用
减法杂交中的缓冲条件（高盐以及螯合镁的柠檬酸盐）与PCR不相容，因此在减法步骤后需要沉淀。
寻找导致最佳扩增而不显着损失引物的循环数，使得引物的序列之间不存在竞争。条件在实验之间通常是稳定的。因此，一旦已经为样品子集确定了最佳条件，它们也证明适合于来自不同实验的其他样品。在我们的情况下，在14个循环时达到最佳扩增，并且使用另外的样品的进一步测试确认了14个循环为最佳，而不需要进一步优化。
保持PCR的其余部分作为备份

食谱

多聚体提取缓冲液（PEB）
110 mM Tris-HCl，pH 8.8
100mM蔗糖 100 mM KCl
75mM NaCl 20mM MgCl 2/
12.5 mM EGTA
3 mM DTT
6.25μl/ml洗涤剂混合物
25μl/ml Triton X-100 37.5μg/ml放线菌酮 25μg/ml氯霉素
提取前准备新鲜，并保持冰上，直到使用
蔗糖垫A（SCA）
1.75 M蔗糖
400mM Tris-HCl，pH9.0
200 mM KCl
5mM EGTA
35mM MgCl 2
5 mM DTT
50μg/ml放线菌酮 50μg/ml氯霉素
提前准备（减去DTT和抗生素）。高压灭菌不超过15分钟，使1.2毫升等分，并存储在-20°C。在使用前添加每个实验新鲜的最后三种化合物。
蔗糖梯度解决方案
50％/10％（w/v）蔗糖 40mM Tris-HCl，pH 8.4
20 mM KCl
10mM MgCl 2/
50μg/ml放线菌酮 50μg/ml氯霉素
1μg/ml SUPERase-In
在实验当天准备新鲜的
多聚体消化缓冲液（PDB）
20mM Tris-HCl，pH 7.8
150mM NaCl 5mM MgCl 2/
50μg/ml Triton X-100 1 mM DTT
100μg/ml放线菌酮
12μlTURBO DNase 2 U /μl/4.5 ml消化体积
10μlRNase I/4.5ml消化缓冲液
准备在提取的日子，并保持冰
蔗糖垫B（SCB）
1.75 M蔗糖
20mM Tris-HCl，pH 7.8
150mM NaCl 5mM MgCl 2/
5 mM DTT
50μg/ml放线菌酮 50μg/ml氯霉素
1μl/ml SUPERase-In
提前准备（减去最后四种成分），高压灭菌不超过15分钟。使1.2毫升等分，存储在-20°C。在使用前，为每个实验新添加最后四种化合物。
Polysome重悬浮缓冲液（PRB）
200mM Tris-HCl，pH 8.4
200 mM KCl
25mM EGTA
35mM MgCl 2
50μg/ml放线菌酮 50μg/ml氯霉素
1μl/ml SUPERase-In
准备提取的日子，并保持在冰
总RNA提取缓冲液（TREB）
200mM Tris-HCl，pH8.0 400mM LiCl 25mM EDTA
1％SDS
提前准备（溶液保存几个月），并在室温下保存
碱性片段缓冲液（2x）
2mM EDTA 100mM Na 2 CO 3，pH 9.2 该溶液通过将15份100mM Na 2 CO 3和110份100mM NaHCO 3混合来制备。它将与气态CO 2平衡并随时间升高pH。它可以在密封的一次性使用的等分试样在室温下储存一年以上
碱性碎裂停止/沉淀溶液
60微升3 M NaOAc
2μlGlycoBlue 15 mg/ml
每次反应500μl无RNA酶的水
在使用前准备
TAE（Tris /乙酸盐/EDTA缓冲液）（50x） 2 M Tris碱
1M乙酸
50 mM EDTA
TBE（Tris /硼酸盐/EDTA缓冲液）（5x）
445mM Tris碱
445mM硼酸 10 mM EDTA
使用前将浓缩的储备缓冲液稀释至1倍。
RNA凝胶提取缓冲液（GEB）
300mM NaOAc，pH 5.5 1mM EDTA
0.25％SDS
DNA凝胶提取缓冲液（STE）
300 mM NaCl
10mM Tris-HCl，pH8.0 1mM EDTA
SSC（20x）
3 M NaCl
300mM柠檬酸三钠（Na 3 H 6 H 5 O 7）。
用HCl调节至pH7.0
减法结合/洗涤缓冲液（2x）
400μl5M NaCl
2μl0.5M EDTA
10μl1M Tris-HCl，pH 7.5
590μl水
8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶（12ml） 6.3ml MilliQ水
3.2ml 30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.4 ml 5x TBE
84微升10％APS
10μlTEMED
非变性负载染料（6x）
60％（v/v）甘油 0.03％（w/v）溴酚蓝

致谢

这项工作是支持的NSF拨款MCB 1158181和0519869到J.M.A。 MCB 0923727 to J.M.A.和A.N.S。 IOS 1444561 to J.M.A.，A.N.S.，and S.H。 NCSU-RISF到S.H.和J.M.A。和玛丽·居里COFUND U-移动博士后研究金C.M. （由马拉加大学和欧盟7FP GA N_246550共同资助）。我们感谢Nick Ingolia对在工厂中实施和解决这个协议的帮助。

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