材料和试剂

番茄种子（ Solanum lycopersicum Mill。cv。Ailsa Craig）
蛭石（Asfaltex SA，TERMITA ）
氢氧化钾（KOH）（Scharlab，目录号：PO0275）
硫酸钾（K 2 SO 4）（Scharlab，目录号：PO0365）
正磷酸（H 3 PO 4）（Scharlab，目录号：AC1100）
硫酸铵[（NH 4）2 SO 4]（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：4628）
硫酸钙二水合物（CaSO 4·2H 2 O）（Scharlab，cataleg number：CA0285）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Scharlab，目录号：MA0085）
硼酸（H 3 BO 3）（AppliChem，目录号：131015）
硫酸锰（II）一水合物（MnSO 4）（Scharlab，目录号：MA0131）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Scharlab，目录号：CI0207）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Scharlab，目录号：CO0101）
三氧化钼（MoO 3）（Panreac，Vidrafoc，目录号：142791）
Sequestrene（Fe 6％）（Syngenta）
2-（N-吗啉代）乙磺酸钠盐（MES钠盐）（Sigma-Aldrich，目录号：M3885）
DL-α-（二氟甲基）精氨酸（DFMA）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-211368）
DL-α-（二氟甲基）鸟氨酸盐酸盐（DFMO）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-252762）
蒸馏水
营养液（见配方）
抑制剂混合（参见配方）

设备

植物生长室（A.S.L Snijders）
盆（50ml）（Pppppmann，型号：Serie TO）
pH计（HACH LANGE SPAIN，CRISON，型号：GLP21）

软件

Windows V.5的Statgraphics-plus软件（Statistical Graphics Corp.，Rockville，MD，USA）

程序

番茄生长条件
1. 在生长室中，在以下环境条件下，在具有100％蛭石的盆（50ml）中发芽番茄种子（Emanica Solanum lycopersicum Mill。cv.Ailsa Craig）：16/8小时的光/，温度为24/18℃，光强度为200μmol/m 2 - s -1 s -1，相对湿度为60％。
2. 种子每周用约50ml /罐的蒸馏水灌溉1周。
3. 幼苗每周用约50ml /盆营养液灌溉两次，持续3周。 N以[（NH 4）2 SO 4] 0.33g/L的形式提供。
4. 用1mM KOH将营养液的pH调节至6.0
抑制剂混合物在番茄植物上的应用
1. 将如上所述生长的20个一致的番茄植物分成两组（10个植物未处理，10个植物用抑制剂溶液处理）。
2. 21天的番茄植物用2ml抑制剂混合物通过土壤灌注处理（每个盆中的最终浓度为DMFA 80nM和DFMO 200nM）
3. 通过土壤灌注用4ml抑制剂混合物处理23天的番茄植物（每个盆中的最终浓度为DMFA 160nM和DFMO 400nM）。
4. 用8ml抑制剂混合物（每个罐中的最终浓度为DMFA 320nM和DFMO 800nM）处理25日龄和27日龄的番茄植物（图1）。抑制剂混合处理不会产生番茄生长的变化（图2）
5. 在最后一次处理后24小时，收集处理或未处理的番茄植物的第三和第四片真叶（图3）并储存在-80℃。
6. 将10株植物的池在液体N 2中在研钵中压碎，并将0.2g进一步用于腐胺提取。
7. 实现三个生物复制。
腐殖质量
1. 按照Sanchez-Lopez等人的方案实现腐胺定量。（2009）通过离子对LC与电喷雾串联质谱联用
2. 腐胺含量表示为三次独立实验的平均值（Fernández-Crespo等人，2015）。
  
  图1.抑制剂混合物在蛭石中生长的番茄植物的应用
  
  图2.用抑制剂混合物处理的番茄植物不显示生长的变化。A.对照和处理的21日龄番茄植株; B.在抑制剂处理一周后的相同植物
  
  图3.具有五片真叶的番茄植株。箭头指示为腐胺定量收集的番茄植株的第三和第四片真叶。

数据分析

使用Windows V.5（Statistical Graphics Corp.，Rockville，MD，USA）的Statgraphics-plus软件中的单向方差分析进行统计分析。计算腐胺含量，并用标准误差表示，并使用Fisher最小显着差异检验在95％置信区间进行比较。实验重复三次。

笔记

Fernández-Crespo等人。（2015）证明了与含有NH 4+++作为单独N源的营养溶液一起生长的番茄植物与提供N的对照植物相比显示出高的腐胺含量作为NO 3 - 形式[（KNO 3）（4mM）和Ca（NO 3） - ] （NH 4）2 SO 3（5mM）]生长的番茄植物中测试通过抑制剂应用的腐胺减少（35.3％）。 4 作为N源。

食谱

营养液
0.33g/L（NH 4）2 SO 4 4
0.35g/L K 2 SO 4 4/s 0.07ml/L H 3 PO 4 4/
0.04g/L MgSO 4·7H 2 O·h/v 0.54g/L CaSO 4·2H 2 O·h/v 2.86mg/L H _{3 BO}
2.2mg/L ZnSO 4·7H 2 O·h/v 0.11mg/L CuSO 4·5H 2 O·h/v 0.15mg/L MnSO 4·
0.09mg/L MoO 3
6.7mg/L sequestrene（6％Fe）
217mg/L MES钠盐
用1mM KOH将pH调节至6.0
抑制剂混和
DL-α-（二氟甲基）精氨酸DFMA（2mM） DL-α-（二氟甲基）鸟氨酸盐酸盐DFMO（5mM）将两种化合物溶于蒸馏水中。
注意：两种解决方案（营养液和抑制剂混合）不需要灭菌。

致谢

这项工作得到了西班牙科学和创新部（AGL2013-49023-C-2-R）的资助。此协议已修改自Mochou 等。（2008）。

参考文献

Fallon，KM和Phillips，R。（1988）。多胺与胡萝卜细胞培养中的生长相关。植物生理学88（1）：224-227。
Fernandez-Crespo，E.，Scalschi，L.，Llorens，E.，Garcia-Agustin，P.和Camanes，G.（2015）。 NH ⁺保护番茄植物免受丁香假单胞菌通过激活系统性获得适应性。 66（21）：6777-6790。
Moschou，PN，Paschalidis，KA，Delis，ID，Andriopoulou，AH，Lagiotis，GD，Yakoumakis，DI和Roubelakis-Angelakis，KA（2008）。亚麻子外排和由非生物胁迫诱导的质外体中的氧化负责H 2 O 2亚型，/sub>在烟草中指导耐受性反应的签名。植物细胞 20（6）：1708-1724。
Perez-Amador，MA，Leon，J.，Green，PJ和Carbonell，J.（2002）。诱导精氨酸脱羧酶 ADC2 基因提供了多胺参与拟南芥中伤口应答的证据。植物生理 130（3）：1454-1463
Sanchez-Lopez，J.，Camanes，G.，Flors，V.，Vicent，C.，Pastor，V。，Vicedo，B.，Cerezo，M.and Garcia-Agustin，P.（2009）植物样品中的非衍生多胺分析通过与电喷雾串联质谱联用的离子对LC来进行非衍生多胺分析光谱法。植物生理学（Plant Physiol Biochem）47（7）：592-598。
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Tiburcio，AF，Altabella，T.，Bitrian，M.和Alcazar，R。（2014）。植物寿命期间聚胺的作用：从发育到胁迫。 240（1）：1-18。
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