材料和试剂

15ml离心管（Corning，目录号：430052）
50ml离心管（Corning，目录号：430290）
12孔板（Corning，Costar ，目录号：3737）
新生小狗（老鼠，P0-P2）
聚-D-赖氨酸（PDL）（Sigma-Aldrich，目录号：P6407-5MG）
乙醇
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11995065）
胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，Hyclone ，目录号：SH30088.03）
10,000 U/ml青霉素 - 链霉素（Pen/Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15140122）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：24020117）
1 M HEPES缓冲溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630080）
葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：D16-3）
胰蛋白酶，粉末（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：27250018）
胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：T6522-100MG）
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）（Sigma-Aldrich，目录号：DN25-100MG）
培养基（500ml）（参见配方）
解剖介质（500ml）（见配方）
2.5％胰蛋白酶（20ml）（参见配方）
1mg/ml胰蛋白酶抑制剂（20ml）（见Recipes）
10mg/ml脱氧核糖核酸酶（20ml）（见配方）

设备

通气盖T-75培养瓶（Corning，目录号：3276）
解剖工具

精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14060-09）
弹簧剪（Fine Science Tools，目录号：15009-08）
弯曲标准镊子（Fine Science Tools，目录号：11052-10）
精细镊子（Fine Science Tools，目录号：11370-40）

离心机（Eppendorf，型号：5702）
血细胞计数器
通风罩（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：1323）
CO 2细胞培养孵育器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：50144906）
37℃水浴（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，型号：TSGP02）

程序

根据实验设计，实验所需的小胶质细胞的数量不同。下面我们列出了处理3只新生小鼠幼仔以在两个T-75瓶中产生混合胶质培养物的步骤。在混合培养中，星形胶质细胞在底部形成汇合的细胞层，小胶质细胞在星形胶质层的顶部生长。从两个T-75烧瓶产生的原代小胶质细胞的总量应足以以50,000细胞/cm 2的密度接种四个12孔板。

涂覆两个T-75培养瓶与7毫升每个10微克/毫升PDL 2小时。使用前用蒸馏水洗涤底部3次。
注意：您可以涂覆比所需更多的烧瓶，未使用的涂覆烧瓶可以在4°C储存数个月。我们通常保持烧瓶在塑料包装，以避免污染。
从繁殖笼收集新出生的幼犬。保持小狗在37°C加热板，以保持体温。同时，准备培养实验所需的工具和试剂。喷洒清扫工具和工作空间与75％乙醇。在37℃水浴中预热培养基（"材料和试剂"中的第16号和"配方"中的第1号）。

图1.用于原代小胶质细胞培养的新生小鼠幼崽的过程。（a）使用细剪刀剪断幼崽头。（b）用细剪刀沿着中线从后端到两眼之间的中点切开头皮。（c）当薄的头骨暴露时，将细镊子的一端放在头骨下面，但在脑组织上面，沿着中线拉向鼻涕，使得大脑可以很容易地用弯曲镊子舀出。 >
从加热板上取下幼崽。断头并将头放入包含5ml冷解剖介质（图1a）（"材料和试剂"中的No.17和"Recipes"中的No.2）的6cm培养皿中。使用精细剪刀沿着中线开始头皮，从后面开始，并在鼻子附近结束（图1b）。将精细镊子的一个锋利的尖端在头骨后面的大脑的后端，并通过将末端从后面推到前面切开颅骨（图1c）。使用弯曲镊子舀出大脑，将大脑浸入新的培养皿中的5ml冷的解剖培养基中。
注意：新生小狗有一个透明和软的头骨。使用剪刀剪下颅骨可能会损坏下面脆弱的脑组织。
将含有大脑的培养皿放在解剖显微镜下。小心地去除脑膜（读者可以参考由Bowyer等人提出的视频。，2012为这一步），并收集皮质和海马。如果你使用3只小狗，你会得到6个半。放置3个半培养皿与5毫升解剖介质，并使用弹簧剪刀将组织切成小块。
将每个碟的内容物转移到50ml管中。用解剖培养基洗涤培养皿，收集培养皿上剩余的任何组织，并重复转移。填充50ml管，达到最终体积为30毫升解剖介质。
向每个管中加入1.5ml 2.5％胰蛋白酶，并在37℃水浴中孵育15分钟。经常旋转。
加入1.2ml 1mg/ml胰蛋白酶抑制剂并孵育1分钟。加入750微升10毫克/毫升DNA酶消化从死细胞释放的粘性DNA
在400×g离心管5分钟。吸出上清液，用5ml温热的培养基，使用1ml移液管尖端研磨沉淀。转移均匀细胞悬浮液到15毫升管。如果未解离的组织块残留，让他们沉淀，并使用3ml培养基重复研磨和转移步骤。
以400×g离心15ml管5分钟。吸出上清液，并用5ml温热的培养基重悬沉淀。
使用血细胞计数器计数细胞密度
将每个管的细胞以50,000细胞/cm 2的密度铺在一个涂覆的T-75烧瓶中。加入培养基，以在烧瓶中达到15ml的体积。将接种的培养瓶放入具有5％CO 2，100％湿度的CO 2细胞培养箱中，37℃。
第二天更换培养基以去除细胞碎片，然后每5天更换培养基
在5-7天，在烧瓶底部的星形胶质细胞形成融合细胞层（图2）。小胶质细胞和一些少突胶质细胞生长在星形胶质层的顶部。

图2.星形胶质细胞在混合胶质培养物的底部形成连接融合层。箭头指向代表性星形胶质细胞。比例尺=100μm。
收集小胶质细胞，大力点击在台面上的烧瓶，收集浮动细胞在条件培养基（在开始之前不需要更换介质）。所得细胞是纯化的小胶质细胞。使用血细胞计数器计数浮动细胞密度和种子细胞在50,000细胞/cm 2在PDL包被培养容器中。 2小时后，检查小胶质细胞在显微镜下附着在底部。吸出培养基并更换新鲜培养基。小胶质细胞可以在第二天使用（图3）。

图3.纯化的原代小胶质细胞培养物。细胞用小胶质细胞标记蛋白Iba1染色。获取相位对比图像以显示细胞体。比例尺=50μm。

数据分析

获得良好质量的原代小胶质细胞培养是实验的基础，例如吞噬作用，各种处理的RNA和蛋白质分析以及免疫细胞化学染色。然而，初级小胶质细胞培养后的实验的统计分析超出了本协议的范围，因此，数据分析过程在这里不讨论。

笔记

该协议描述了从新生小鼠（P0-P2）的小胶质细胞制备。也可以使用较老的幼崽，因为神经胶质细胞不是有丝分裂后的神经元，但新生的幼崽产生更好的产量。
大多数程序应在无菌通风罩中进行。例外包括幼仔的处理，脑解剖，离心和细胞计数。使用无菌管和餐具。喷雾工具和管子和菜肴的外表面与70％乙醇，在他们进入敞篷前。除了在水浴和培养孵化器中37℃孵育之外，所有步骤在室温下进行，并且应当及时完成以增强细胞的活力。
如果混合的神经胶质细胞达到融合，但不需要立即使用小胶质细胞，则可以传代混合的神经胶质培养物。混合的胶质细胞培养物也可以冷冻并长期储存在由在液氮中含有20％FBS和10％DMSO的DMEM组成的冷冻培养基中。当新的传代或回收的冷冻细胞达到汇合时，小神经胶质细胞可以在融合细胞层的顶部生长并通过敲打来纯化。
在该培养条件下，星形胶质细胞和小神经胶质细胞比少突胶质细胞生长更强。在轻拍混合胶质细胞培养物后，收集的浮动细胞可能含有一些少突胶质细胞。然而，小胶质细胞比少突胶质细胞具有更强的附着能力。在接种浮细胞后，小胶质细胞比少突胶质细胞更有效地附着于培养容器底部。在接种后2小时，在加入新鲜培养基之前，吸去旧培养基将除去未附着的污染少突胶质细胞。

食谱

培养基（500ml）
450 ml DMEM
50ml FBS
或者，您可以添加5毫升Pen/Strep
过滤并储存在4°C
解剖介质（500ml）
450 ml 1x HBSS
5 ml 1 M HEPES
3 g葡萄糖粉
5ml Pen/Strep溶液
过滤并储存在4°C
2.5％胰蛋白酶（20ml） 0.5克胰蛋白酶粉溶解在20ml HBSS中过滤，等分，并储存在-20°C
1mg/ml胰蛋白酶抑制剂（20ml） 0.02克胰蛋白酶抑制剂
过滤，等分，并储存在-20°C
10mg/ml DNA酶（20ml） 0.2g DNase I粉末溶于20ml HBSS中过滤，分装，并在-20°C下保存

致谢

我们感谢来自NIH（AG032051，AG020670和NS076117到H.Z.）的R01s支持这项工作。

参考文献

Bowyer，JF，Thomas，M.，Patterson，TA，George，NI，Runnells，JA和Levi，MS（2012）。来自大鼠脑的脑表面脉管系统和相关脑膜和脉络丛的解剖的视觉描述。 em>（69）：e4285
Edmonson，CA，Ziats，MN和Rennert，OM（2016）。小胶质细胞在自闭症谱系障碍中的非炎性作用。前neurol 7：9.
Fan，Z.，Okello，AA，Brooks，DJ和Edison，P.（2015）。小胶质细胞活化和淀粉样蛋白对阿尔茨海默病中神经元功能的纵向影响。脑 138（Pt 12）：3685-3698。 >
Garden，GA和Campbell，BM（2016）。 Glial 人类中枢神经系统疾病中的生物标志物。 Glia 64（10）：1755-1771。
Henn，A.，Lund，S.，Hedtjarn，M.，Schrattenholz，A.，Porzgen，P.和Leist，M。（2009）。 BV2细胞作为原代小胶质细胞培养物的替代模型系统或用于检查脑炎症的动物实验的适合性。 ALTEX 26（2）：83-94。
Koshimori，Y.，Ko，JH，Mizrahi，R.，Rusjan，P.，Mabrouk，R.，Jacobs，MF，Christopher，L.，Hamani，C.，Lang，AE，Wilson，AA，Houle，和Strafella，AP（2015）。成像纹状体小胶质细胞激活在帕金森病患者中。 PLoS One 10（9）：e0138721。
Loeffler，DA，Camp，DM and Bennett，DA（2008）。斑块补体激活和阿尔茨海默病中的认知缺失 5：9.
Lian，H.，Litvinchuk，A.，Chiang，AC，Aithmitti，N.，Jankowsky，JL和Zheng，H。（2016）。通过补体激活的星形胶质细胞 - 小胶质细胞交谈可调节阿尔茨海默氏病小鼠模型中的淀粉样蛋白病理学 J Neurosci 36（2）：577-589。
McKercher，SR，Torbett，BE，Anderson，KL，Henkel，GW，Vestal，DJ，Baribault，H.，Klemsz，M.，Feeney，AJ，Wu，??GE，Paige，CJand Maki，RA（1996） ; PU.1基因的靶向破坏导致多种造血异常。 EMBO J 15（20）：5647-5658
Michaelidou，I.，Willems，JG，Kooi，EJ，van Eden，C.，Gold，SM，Geurts，JJ，Baas，F.，Huitinga，I。和Ramaglia， ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25727254"target ="_ blank">多发性硬化海马中补体C1q-C3相关的突触变化。 Ann Neurol 77（6）：1007-1026。
Schwartz，M.，Kipnis，J.，Rivest，S.和Prat，A.（2013）。免疫细胞如何支持健康，疾病和衰老的大脑？ J Neurosci 33（45）：17587-17596。
Stevens，B.，Allen，NJ，Vazquez，LE，Howell，GR，Christopherson，KS，Nouri，N.，Micheva，KD，Mehalow，AK，Huberman，AD，Stafford， AM，Lambris，JD，Smith，SJ，John，SW和Barres，BA（2007）。经典补体级联介导CNS突触消除。 Cell 131（6）：1164-1178。
Stephen，AH，Barres，BA和Stevens，B。（2012）。补体系统：在发育和疾病期间突触修剪中的意想不到的作用。 Annu Rev Neurosci 35：369-389。
Stansley，B.，Post，J.和Hensley，K。（2012）。用于研究阿尔茨海默氏病的小胶质细胞生物学的细胞培养系统的比较综述 J Neuroinflammation 9：115.
Wang，Y.，Cella，M.，Mallinson，K.，Ulrich，JD，Young，KL，Robinette，ML，Gilfillan，S.，Krishnan，GM，Sudhakar，S.，Zinselmeyer，BH，Holtzman，DM，Cirrito ，JR和Colonna，M.（2015）。 TREM2脂质感受在阿尔茨海默病模型中维持小神经胶质反应。 Cell 160（6）：1061-1071。
这些研究结果表明，这些研究结果表明，该方法能够有效地抑制细胞凋亡。小鼠和人类中的TREM2单倍体缺失会损害小胶质细胞屏障功能减少淀粉样蛋白紧缩和严重轴突营养不良。 Neuron 90（4）：724-739。