材料和试剂

50ml具有圆锥形底部的聚丙烯离心管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
20ml标准玻璃试管（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S63289）
10ml Oak Ridge高速PPCO离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：3119-0010）
1.5ml聚丙烯微量离心管（Eppendorf，目录号：0030125150）
0.20μm乙酸纤维素膜过滤器，无菌（Toyo Roshi Kaisha，目录号：25CS020AS）
微铲
细长聚球藻 PCC 7942（ http：//cyanobacteria.web .pasteur.fr/）
BG11作为培养基（Rippka等人，1979）
直径为0.1mm的氧化锆/二氧化硅珠（BioSpec，目录号：11079101z）
抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A7631）
连二亚硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：157953）
甲醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-13995）
HEPES（Dojindo Molecular Techologies，目录号：GB10）
氢氧化钠（NaOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：198-13765）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
Tricine（Dojindo Molecular Techologies，目录号：GB19）
盐酸（HCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：080-01066）
铁氰化钾（III）（Sigma-Aldrich，目录号：702587）
氢醌（Sigma-Aldrich，目录号：H9003）
HN缓冲区（参见配方）
50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.5）（见Recipes）
100 mM铁氰化钾溶液（参见配方）

设备

涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
装备有ST-720M摆动转子（16×50ml）的台式离心机（KUBOTA，型号：5220）
装备有RA-150转子（12×12ml）的高速冷冻离心机（KUBOTA，型号：7700）
装有1.5ml/2.0ml转子的高速冷冻微量离心机（Tomy，型号：MX-301）
装有锥形微尖的超声波细胞破碎仪（Branson，型号：Sonifier SFX250）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU 640）
300μl微比色皿，10mm光程（Hellma，目录号：105-QS）
PTFE涂覆的镍不锈钢微量刮刀（Kokugo，目录号：101-378-51）

程序

将蓝细菌细胞在30℃下在200ml BG11培养基中培养至具有生长的指数期（在730nm处的光密度）的照明（10Wm -2 -2s）和通气。0.3 to 0.4）。
通过在室温下以3,000xg离心5分钟（台式离心机）在4×50ml管中收获细胞。通过倾析弃去上清液，并通过将其重悬浮于50ml冰冷的HN缓冲液中，在这些50ml管中的一个中收集沉淀的细胞。重复细胞洗涤步骤，即，离心 - 再悬浮步骤，两次，细胞最终重悬浮在3ml的相同缓冲液中。将细胞悬液转移到玻璃试管中。在冰暗的灯光下工作以进行所有后续步骤。
通过涡流混合器搅拌细胞悬浮液与2克氧化锆/硅胶珠破裂细胞。以最大速度搅拌30秒，以60秒的冰冷间隔重复4次。将全细胞提取物转移到PPCO离心管中
离心细胞提取物在3,000×g离心5分钟，在4℃下除去细胞碎片（高速冷冻离心机）。将上清液转移到PPCO离心管中
在4℃下将上清液以30,000×g离心20分钟（高速冷冻离心机）。通过吸取弃上清液和重悬在5ml预冷的HN缓冲液中的沉淀。重复该离心 - 再悬浮步骤两次，最后将沉淀物重悬浮在小体积（<0.5ml）的相同预冷缓冲液中。
将重悬的膜样品转移到微量离心管中以进行细胞色素和P 700的测量。将样品分成五份，待储存于-80℃直至使用。
用50mM Tricine缓冲液（pH7.5）稀释样品至50至70μM的叶绿素浓度（参见注释1）。
超声处理稀释的样品两次，在20瓦下1秒，在冰上间隔10秒，以分散膜（超声波细胞破碎器）。将200μl超声处理的样品转移到微量比色皿中。
加入2微升100 mM铁氰化钾溶液（终浓度1 mM）到微量比色杯中的样品，并用微量刮刀充分混合。在室温下孵育样品几分钟以完全氧化细胞色素和P 700。
在分光光度计中设置微量比色皿，并在室温下记录在500-750nm波长范围内的吸收光谱。完全氧化可以通过观察光谱没有进一步变化来确认（见注2）
向微量比色皿中的样品中加入一些氢醌的粉末颗粒，并用微量刮刀将其充分混合以减少Cyt em。在室温下在步骤10中记录相同波长范围的吸收光谱。检查在该步骤减去step10的差光谱中的Δλ最大在556.5nm处呈现。重复步骤11几次，直到Cyt f 完全减少，即，直到光谱没有进一步变化（氢醌的最终量， ca 0.02?0.09mg）（见注2）。
要减少样品中的Cyt b ₅₅₉和P ₇₀₀，请将几个抗坏血酸钠粉末颗粒样品在微量比色皿中，并用微量刮勺充分混合。记录在室温下的吸收光谱。检查在559nm处显示该步骤减去步骤11的Cyt 559 差异光谱中的Δλ最大值。还检查在700nm处显示该步骤减去步骤10的P <700>差光谱中的Δλ最大值。重复步骤12几次直到Cyt 和完全减少，没有进一步的变化（抗坏血酸钠的最终量，ca ，0.04?0.16mg）（见注2）。
向微量比色杯中的样品中加入几个连二亚硫酸钠的粉末颗粒，并用微量刮刀将其充分混合以减少Cyt 6 b 6。记录在室温下的吸收光谱。检查在该步骤减去步骤12的Cyt bb 6+差异光谱中的Δλ最大值展现在563nm。重复步骤13几次，直到Cyt b ₆完全缩减，即变化（亚硫酸氢钠的最终量， <0.03>）。（见注2）。
定量Cyt b ，分别使用以下公式[1]，[2]，[3]和[4]（参见注释3）定量结果应以至少三次实验的平均值±标准偏差表示细胞色素b [sub] 559 [μM] = 64.5x {（A 559 Sub A 580）步骤12） - （A <559 - A <580> ）氧化（步骤11）细胞色素b [sub] 6 [μM] = 71.4x {（a 563 Sub A 580）步骤13） - （A <563 - 580 ）氧化（步骤12）细胞色素 [μM] = 46.5×{（556.5 - 子544.5 ）减少（步骤11） A556.5 - A _544.5）_{氧化（步骤10）}

代表数据

图1和2显示了使用集胞藻属的类囊体膜的差异光谱的代表性实例。 PCC 6803.

图1.在集胞藻中的P <700> 的差异谱。 PCC 6803。样品包括相当于60μM叶绿素的类囊体膜。。

图2.细胞色素在集胞藻中的差异光谱。 PCC 6803。每个样品包括相当于60μM叶绿素a的类囊体膜。

笔记

叶绿素a浓度根据Porra等人的方法测定。（1989）。在用100％甲醇提取膜样品中的叶绿素a后，测量在650.0,665.2和730nm的吸光度，并通过使用下式计算叶绿素a浓度[5] ]。
叶绿素a [μM] = 18.22×（A 665.2 -A 730）-9.55×（A 652.0- A ₇₃₀）[5]
小心避免加入过量的氧化剂或还原剂，因为它会引起样品的聚集和/或漂白。
使用的差分消光系数为Δε（700-730nm）= 64mM ·cm -1 -1 （P < ），Δε（559-580nm）= 15.5mM cm -1 （Cyt 559 ），Δε（563-580nm）= 14.0mM -1 ·cm <-1> （556.5-544.5nm）= 21.5mM ^{- 1} ），其中， -1 （细胞色素的?F的），已经由桧山和柯（1972年），Garewal和沃瑟曼（1974年），斯图尔特和沃瑟曼（1973），和报道的B?hme的等al 。（1980）。

食谱

HN缓冲液（5mM HEPES-NaOH [pH7.5]，10mM NaCl）将1.19g的HEPES和0.58g的NaCl溶解在?800ml的ddH 2 O中。
用NaOH调节pH至7.5 将ddH <2> O加入到最终体积为1000ml
过滤灭菌（0.20μm乙酸纤维素膜过滤器）
在室温下贮存
50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.5）将8.96g三羟甲基丙氨酸溶解至?800ml ddH 2 O 2 / 用HCl
调节pH至7.5 将ddH <2> O加入到最终体积为1000ml
过滤灭菌（0.20μm乙酸纤维素膜过滤器）
在室温下贮存
100mM铁氰化钾溶液将0.329g铁氰化钾（III）溶解于ddH 2 O中，最终体积为10ml
此溶液应在使用前准备好，并储存在暗处

致谢

我们非常感谢博士。 Fujita和Murakami谁建立了这个协议（1987）。这项工作得到日本科学技术局的Grants-in-Aid（CREST）的部分支持。

参考文献

B?hme，H.，Pelzer，B。和Boger，P。（1980）。来自蓝绿藻螺旋藻的细胞色素e -556.5的纯化和表征 Biochim Biophys Acta > 592（3）：528-535。
藤田，Y.村上，A.（1987）&NBSP; 法规光系统-I中的蓝藻光合作用系统化学计量电子传输成分和光-II复合物和其捕光天线和cytochrome-的乙₆ 的cytochrome-的的f complex。 Plant Cell Physiol 28（8）：1547-1553。
Garewal，HS和沃瑟曼，AR（1974）&NBSP; 海卫X-100-4M尿素作为膜蛋白的提取介质。 I.叶绿体细胞色素的纯化
Hiyama，T.和Ke，B。（1972）。差异光谱和P 700的消光系数。 Biochim Biophys Acta 267（1）：160-171。
Porra，RJ，汤普森，西澳和Kriedemann，PE（1989）NBSP; <一类="KE-的insertFile的"href ="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470"目标=" _blank">准确的消光系数和联立方程测定叶绿素&NBSP的测定的在的和&NBSP;的乙的有4种不同的溶剂萃取 - 由atomic-的叶绿素标准浓度的核查吸收光谱法。 Biochim Biophys Acta 975（3）：384-394。
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，JB，Herdman M.和Stainer RY（1979）。通用分配，菌株历史和蓝细菌纯培养物的性质。

J Gen Microbiol ）：1-61。
Stuart，AL和Wasserman，AR（1973）。纯化的细胞色素b ₆ 。一种紧密结合的叶绿体膜中的蛋白质。 Biochim Biophys Acta 314（3）：284-297。