材料和试剂

Accudenz（Accurate Chemical& Scientific Corporation）
蛋白酶抑制剂
1. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：78830-5G）
2. 抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A3428-10MG）
3. 胃酶抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318-5MG）
NaN ₃
氟化钠（NaF）
Tris-HCl
β-巯基乙醇
TCA
山梨醇
HEPES-KOH
球形缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

Dounce匀浆器（Cole-Parmer）
折射计（Bausch& Lomb Incorporated）
Beckman转子

程序

细胞裂解液的制备
1. 收集50OD的细胞并在10mM NaN 3，1mM氟化钠（NaF），50mM Tris-HCl（pH7.5）中洗涤一次以中毒能量依赖性过程。
2. 将它们在室温（RT）下在10OD/ml 100mM Tris-HCl（pH 9.4），50mMβ-巯基乙醇，10mM NaN 3中孵育10分钟以还原细胞壁
3. 洗涤并重悬于球形造粒缓冲液30〜50 OD/ml，并在37℃孵育直至90％的细胞转化为原生质球（30〜40分钟）。
4. 在3,000×g离心5分钟以收集原生质球。
5. 重悬于2ml裂解缓冲液中。在dounce匀浆器中裂解细胞（紧杵，15次）
6. 离心裂解物在500×g离心5分钟以清除未破碎的细胞。如有必要，离心两次。
制备Accudenz梯度
1. 准备在裂解缓冲液中的梯度溶液。用以下重量/体积量的Accudenz产生梯度：1ml 43％，1ml 37％，1ml 31％，1.5ml 27％，1.5ml 23％，1.5ml 20％，1ml 17％，1ml 13 ％和1ml 8％
2. 使用折射计测量标准Accudenz梯度的折射率，并基于由五个称重的标准物产生的标准曲线将这些值转换成克/毫升。
3. 测量收集的馏分的折射率，以确定它们的密度
通过平衡沉降分馏
1. 可以基于它们的特征密度分离细胞内膜，并且可以检查目的蛋白质与已知膜标记蛋白质的共分级。
2. 将澄清的裂解物装载在Accudenz梯度（8％-43％）的顶部，并在Beckman转子中在4℃以170,000×g离心18小时。使用缓慢中断。
3. 从梯度的顶部收集12个馏分; 用10％TCA沉淀蛋白质。

蛋白质印迹

目录号码或来源（MP生物医学）	酵母基因名称	抗体识别的酵母抗原	抗原所在的酵母细胞器	单克隆或多克隆，宿主	Western blots （g/ml）
A-6427	Vma 2	V-ATP酶60kDa亚基	真空膜
A-6429	Dpm 1	Dol-P-Man合成	ER
A-6457	PGK	3-磷酸甘油酯	细胞质
		激酶

食谱

球形缓冲液

球形缓冲液
100 ml
200 ml

1 M山梨醇（FW 182.17）

10mM NaN 3 sub

10μg/μl溶血酶或20〜40U/OD溶血酶

40mM HEPES-KOH（pH7.5）
裂解缓冲液

裂解缓冲液
100 ml
200 ml

0.2M山梨醇（FW 182.17）

50mM KOAc

2mM EDTA

20mM HEPES-KOH（pH 6.8）
将蛋白酶抑制剂加至终浓度（20μg/ml PMSF，5μg/ml抗蛋白酶，1μg/ml抑肽酶，亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制剂，以及10μg/mlα亚基） - 球蛋白）。

致谢

该协议已经在约翰霍普金斯医学院的Espenshade实验室中修改和改编。资助支持不同的项目，使用这个协议来自NIH - 国家心脏，肺和血液研究所，国家过敏和传染病研究所，胰腺癌行动网络和美国心脏协会。

参考

Cowles，C.R.，Odorizzi，G.，Payne，G.S。和Emr，S.D。（1997）。 AP-3衔接子复合物对于货物选择性转运至酵母液泡至关重要。 Cell 91（1）：109-118。