材料和试剂

1.7 ml微量离心管
酸洗涤的小玻璃珠，425-600μm（30-40 U.S.筛）（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
大玻璃珠，5mm（Corning，目录号：7268-5）
细胞刮刀（Corning，Falcon ，目录号：353085）
电穿孔杯（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：FB101）
培养皿（100×15mm）（VWR，目录号：89038-968）
ElectroMAX TMDH10β细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18290015）
酿酒酵母菌株（BY4741）（GE Healthcare Dharmacon，目录号：YS1048或其它ura3阴性菌株）。
E。大肠杆菌DH10β atp/gidB ::着陆垫盒。含有整合着陆垫盒的四环素抗性菌株（用于将捕获的DNA转移到染色体中）（Addgene，目录号：83036）
pLLX13质粒或另一种合适的酵母/细菌穿梭载体（Addgene，目录号：79825）
pLLX8质粒或编码所需抗生素抗性盒的另一合适载体（Addgene，目录号：79838）
pKD46，温度敏感的λ红色重组酶表达质粒或类似物（Datsenko和Wanner，2000）
用于λRed重组酶和I-SceI的pTKred质粒，温度敏感的细菌表达载体（Addgene，目录号：41062）
基因特异性引物（参见表1）
酵母氮源与硫酸铵（MP Biomedicals，目录号：114027-532）
CSM-URA，尿嘧啶滴出补充剂（MP Biomedicals，目录号：4511-222）
D-葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：D16-10）
琼脂（Thermo Fisher Scientific，Fisher scientific，目录号：BP1423-2）
L - （+） - 阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256-100）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518-25G）
卡那霉素一硫酸盐（MP Biomedicals，目录号：02150029）
盐酸四环素（Sigma-Aldrich，目录号：T7660）
壮观霉素二盐酸盐五水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S9007-5G）
蒸馏水，去离子水
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M2643-500G）
KOD热启动DNA聚合酶（EMD Millipore，目录号：71-086-3）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
NheI-HF限制酶（New England Biolabs，目录号：R3131S）
PmeI限制酶（New England Biolabs，目录号：R0560S）
MluI-HF限制酶（New England Biolabs，目录号：R3198S）
酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP1422-2）
蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP1420-2）
甘油（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP229-4）
聚乙二醇3350（PEG 3350）（Sigma-Aldrich，目录号：202444）
乙酸锂（LiOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：517992）
来自鲑鱼睾丸的DNA钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：D1626）重悬于TE缓冲液（2mg/ml）中
Tris-HCl，pH8.0（Promega，目录号：H5123）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134-500G）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27104）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014-500G）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405-250G）
乙酸钠（NaOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
选择性抗生素
卡那霉素一硫酸盐（1,000x储备液）（见配方）
氨苄青霉素钠盐（1,000x原液）（见配方）
盐酸四环素（1,000x原液）（参见配方）
壮观霉素二氢氯化物五水合物（1,000x储备液）（见配方）
CSM-Ura选择性培养基（参见配方）
YEPD媒体（见配方）
TE缓冲区（参见配方）
SOB肉汤（见配方）
SOC肉汤（见配方）

设备

100-150ml锥形瓶
Vortex（Scientific Industries，目录号：SI-0136）
孵育器，设置为37°C和30°C
水浴或加热块，设置为42°C，37°C和30°C
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
大型离心机，能够处理高达50毫升（用于制造胜任的酵母和细菌）
电泳系统
紫外透射仪
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：PTC 200）或任何其他常规热循环仪
GenePulser II电穿孔系统（Bio-Rad Laboratories）或其他电穿孔装置
Nanodrop Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop Lite）或适用于定量DNA浓度的任何其他设备/方法
滚筒或振动器

程序

第I部分：生成捕获向量

注意：本节的目的是创建一个捕获载体（图1），一种随后可用于捕获DNA的大片段的质粒（第二部分）。在设计方案的这一点上，需要做出关于是否设计所得捕获载体以包括侧翼独特的"着陆垫"序列的决定，如果最终目标是将DNA片段引入使用先前由Kuhlman和Cox（2010）（第III部分）详细描述的Landing Pad技术在细菌染色体内定义位点。

待重组的DNA的制备以产生捕获载体
1. DNA片段概述
  如图1所示，通过经由酵母内源性同源重组结合DNA的以下4个片段来装配捕获载体：线性化载体，加上3个PCR产生的感兴趣的片段：靶向序列1（TS1），靶向序列2（TS2）和含有氨苄青霉素抗性（β-内酰胺酶）的盒
  1. 载体骨架：pLLX13是9.94kb酵母/em。大肠杆菌穿梭载体，其携带复制起点和选择标记以支持在细菌（oriV-incP 和 tetRA ）和酵母（CEN和 URA3）以及促进细菌通过共轭转移的转移起始（ oriT ）序列（Wolfgang等人，2003）（图1C）。
  2. 靶向序列1（TS1）和2（TS2）：与欲捕获和克隆的区域的上游和下游边缘具有同源性的DNA的1kb区域。使用在一端添加40个碱基对与线性化pLLX13的同源性的引物，以及在另一端包含几个限制性位点的间隔区，通过PCR产生TS1和TS2（图1A，表1）。这可以通过一轮PCR实现。然而，如果期望DNA的捕获区域的染色体整合，则应该将靶向序列侧翼的着陆区序列并入PCR产物中。嵌套PCR用于将这些着陆垫序列插入靶向序列和pLLX13同源区之间（图1B，表1）。
    注意：
    1. 如图1C所示，可以如Kuhlman和Cox（2010）中所述使用存在于接头焊盘序列侧翼的捕获载体中的I-SceI限制性位点，以释放捕获DNA并将其靶向先前设计的接头垫位点。请参阅第III部分和图3。
    2. 结合到TS1 PCR的3'末端和TS2 PCR的5'末端的间隔区提供了用于与氨苄青霉素抗性盒重组（以下）和捕获载体的装配的同源DNA序列。另外，间隔区含有连续的限制性消化位点，用于在与靶DNA序列重组之前线性化捕获载体（图2）。 TS1间隔区包括PmeI和HpaI限制性序列，TS2间隔区包括MluI和PacI限制性位点（图1C，表1）。如果需要，可以通过改变引物序列，即如果位点包含在TS1和/或TS2中，则可以用其它限制性位点替换这些限制性位点。
  3. Amp 盒：插入在TS1和TS2之间的DNA区域，以便利用酵母重组装配捕获载体质粒后使用细菌转化来选择捕获载体质粒。使用提供与靶序列1和2间隔区序列的同源性的引物扩增来自pLLX8的Amp 携带片段。当共转化到感受态细胞中时，这些DNA序列上的侧翼同源性使其能够通过同源重组装配。酿酒厂。
    
    图1.用于产生捕获载体的基于酵母重组的策略的示意图。A.使用所描述的引物通过PCR产生具有小重叠同源区域的片段。重叠的同源序列促进酵母中的重组和装配。这些片段包括与5'和3'靶向序列（TS1和TS2）间隔区（灰色）加上氨苄青霉素抗性盒（Amp ）（绿色）同源的那些。可以通过包括一轮嵌套PCR将接头垫（LP）序列（蓝色）引入捕获载体。初始PCR扩增向间隔区和侧翼着陆区序列引入同源性，而第二轮PCR向pLLX13载体主链引入同源性。当引入酵母中时，3个PCR产生的包含重叠同源序列和线性化（NheI消化的）pLLX13载体骨架的片段经历同源重组以产生可通过在CSM-URA培养基上生长而选择的捕获载体。可以收获所得的捕获载体质粒，并在E中进行选择。通过在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上电镀大肠杆菌。分离靶序列和氨苄青霉素抗性盒的间隔区（灰色）将PmeI和MluI限制性位点引入捕获载体，其可用于确认正确的捕获载体装配。或者，SceI限制性位点可用于释放整个组装的5kb片段。此外，用箭头表示的寡核苷酸pLLX F和pLLX R（表1）可用于对装配的捕获载体进行测序，以确认发生了适当的重组介导的事件。
2. PCR产生的片段（TS1，TS2，AMP ^R）的制备
  1. 使用高保真聚合酶的通用PCR反应混合物：
    16μl蒸馏水
    2.5μlKOD 10x反应缓冲液
    2.5μldNTP（各2mM） 1.5μl25mM MgSO 4 0.5μl正向寡核苷酸20μM（见下文和表1中的寡核苷酸描述） 0.5μl反向寡核苷酸20μM
    1μl模板DNA（50-250ng基因组DNA和1-10ng质粒DNA）
    0.5μlKOD热启动聚合酶（1 U /μl）
  2. 寡核苷酸和模板DNA
    注意：选择正向寡核苷酸（+/- LP）取决于是否需要靶DNA的下游染色体整合。
    1. TS1 PCR（+/- LP）：
      正向寡核苷酸（+ LP）：5_LP1_TS1（寡核苷酸在表1中描述）
      正向寡核苷酸（-LP）：5_pLLX_TS1
      反向寡核苷酸：3_TS1
      模板：基因特异性模板如细菌染色体或毒力质粒DNA
    2. TS2 PCR（+/- LP）：
      正向寡核苷酸：5_TS2
      反向寡核苷酸（+ LP）：3_LP2_TS2
      反向寡核苷酸（-LP）：3_pLLX_TS2
      模板：基因特异性模板如细菌染色体或毒力质粒DNA
    3. 氨苄青霉素抗性盒PCR：
      前向寡核苷酸：5_Amp
      反向寡核苷酸：3_Amp
      模板：pLLX8或含有用于选择的所需抗生素抗性盒的其他质粒
    4. PCR谱：
      注意：根据需要，可以修改这些条件以使用不同的聚合酶或基因特异性引物。
      1个循环，94℃，5分钟
      30个循环，94℃30秒; 55℃30秒; 72℃2-3分钟
      1个循环，72℃10分钟
  3. 预期分段
    TS1和TS2 PCR产物应为〜1kb，Amp ^R盒〜3kb。
  4. 嵌套PCR（如果添加侧翼着陆点[LP]序列）
    准备与上述相同的KOD热启动聚合酶PCR混合物，并进行以下引物和模板修饰：
    1. 嵌套的TS1 PCR寡核苷酸：
      正向寡核苷酸：5_pLLX_LP1
      反向寡核苷酸：3_TS1
      模板：1μl纯化，确认TS1 PCR
    2. 嵌套的TS2 PCR寡核苷酸：
      正向寡核苷酸：5_TS2
      反向寡核苷酸：3_pLLX_LP2
      模板：1μl纯化的，证实的TS2 PCR
  5. 嵌套PCR分析
    TS1和TS2巢式PCR产物仍然约为1kb，但是现在含有与用于下游重组反应的pLLX13载体骨架同源的区域。
  6. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒或其他等效方法清洁PCR产物
3. 线性化载体DNA的制备
  1. 用NheI-HF限制酶消化1μg的pLLX13载体
  2. 凝胶纯化消化的质粒DNA，并在Nanodrop Lite分光光度计或适用于DNA定量的其他设备/方法上定量浓度。
    
    表1.引物序列（5'-3'序列）
    
    ^{这些序列应该添加到基因特异性序列的5'末端（TS1）或3'末端（TS2），以产生可以容易地重组以在酵母中形成捕获载体的PCR产物。
    ^{b
    ^{NNN，表示应添加目标DNA特异性序列。
    ，着陆垫顺序
    下划线
    ，与pLLX8氨苄青霉素抗性盒编码载体的同源性。斜体序列可以替代含有所需抗生素抗性盒的选择载体。}}}
使用酵母重组产生捕获载体
1. 感受态酵母的制备（Gietz和Woods，2002）
  1. 第1天：接种具有大宿主宿主的5ml YEPD肉汤。酿酒酵母菌株，并在滚筒上于30℃温育过夜
  2. 第2天：在分光光度计上测量培养物OD 600，并在100-150ml锥形瓶中将其稀释（传代培养）至50ml新鲜YEPD肉汤中至OD 600，为0.3。
  3. 在30℃下在振荡器上孵育酵母3-5小时，直到酵母细胞经历两次倍增，达到〜1.2的OD 600.
  4. 通过在大离心机中以850×g离心3分钟收获酵母。倾析上清液。
    注意：以更高的x g离心会使酵母颗粒更难以重悬。
  5. 将酵母悬浮于25ml无菌水中
  6. 在大离心机中以850×g离心3分钟以沉淀酵母。倾析上清液。
  7. 重悬在1毫升无菌水中的酵母。
    注意：剩余的酵母可以重悬于10％甘油中，并在-80℃冷冻备用。
2. 酵母转化
3. 分离重组捕获载体
  1. 使用板刮板或无菌移液管尖重新悬浮存在于转化板上的500微升YEPD培养基中的所有酵母菌落。将混合物转移到1.7ml微量离心管中，并通过在2,400×g离心1分钟收获细胞。
  2. 倾析上清液和裂解酵母以使用如下修改的QIAprep Spin MiniPrep Kit方案提取组装的捕获载体：
  3. 将酵母悬浮于250μlP1缓冲液中
  4. 添加250微升的小（425-600微米）酸洗玻璃珠到管和涡流在最大速度设置5分钟，以裂解酵母。
  5. 允许〜1分钟的玻璃珠沉降，然后将酵母裂解液转移到新的1.7毫升微量离心管中。
  6. 加入250μlP2缓冲液，通过颠倒混合4-6次，并在室温下孵育5分钟
  7. 加入350μlN3缓冲液，反转4-6次混合，并在16,500×g下旋转10分钟。
  8. 将上清液转移到QIAprep柱和收集管上，并在16,500×g下旋转30秒。
  9. 倾析流过和用750μlPE洗涤缓冲液洗涤柱。旋转16,500英寸x g 30秒。
  10. 丢弃通过溶液的流，并重新组装离心柱和收集管。旋转16,500英寸x g 1分钟以干燥色谱柱。
  11. 将转移柱转移到新鲜的，标记的1.7ml微量离心管中
  12. 加入40μlEB缓冲液（洗脱缓冲液），在室温下孵育1分钟，并以16,500×g进行最终旋转1分钟。
  13. 混合3微升洗脱的DNA用E。大肠杆菌 ElectroMAXDH10β细胞（或任何合适的感受态大肠杆菌细胞）。
  14. 转移DNA和细菌混合物到0.1毫米电穿孔小杯。
  15. 使用GenePulser II（Bio-Rad Laboratories）或等效电穿孔装置使用制造商的设置进行电穿孔。
    注意：对于GenePulser II，使用1.8 kV和25μF设置与大肠杆菌。
  16. 加入450微升的SOC并孵育1小时在37℃加热块或水浴。
  17. 在含有四环素和氨苄青霉素的LB平板上转化细菌，以选择组合了所有4个DNA片段的重组质粒。转化后一天可能出现菌落，但有时可能需要额外一天才能出现
  18. 为了筛选候选捕获载体集落，将至少4个单菌落分别接种到含有氨苄青霉素和四环素的10ml LB肉汤中，并在37℃下生长过夜。
    注意：我们建议在此步骤使用更大体积的小量制备（最多10 ml），因为pLLX13载体骨架的低拷贝通常导致较低的DNA产量。然后可以将来自所有10ml培养物的细菌沉淀物合并成单个小量制备物。
  19. 第二天早上，使用QIAprep Spin Miniprep Kit按照制造商的说明书收获质粒DNA
数据分析
>：确认捕获矢量
的正确组装从单个细菌转化体中分离的质粒可以通过以下方式分析完整的重组捕获载体的存在：
1. 用SceI消化以释放插入的（〜5kb）TS1-Amp ^R -TS2片段（图1C）。
2. 用PmeI和MluI消化以释放（〜3kb）Amp ^R盒。
3. 使用PCR确认TS1和TS2的存在。
4. 用寡核苷酸pLLX F和pLLX R测序重组的接头（表1和图1）。

第二部分：使用λRed同源重组捕获靶序列

准备转移的捕获载体DNA
使捕获载体线性化以产生DNA片段，使得TS1和TS2作为游离末端可接近，以在引入细菌时促进重组。这将极大地提高λRed重组的效率，并且在重组之前起到去除氨苄青霉素抗性盒（Amp ^R）的作用（图2A）。
1. 用PmeI和MluI消化1μgpLLX13-TS1-amp-TS2捕获载体DNA。注意：HpaI可以用作PmeI的替代品，PacI可以用作MluI的替代品。
2. 凝胶使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化试剂盒根据制造商的说明书纯化〜10kb线性化的捕获载体DNA。
3. 使用Nanodrop Lite分光光度计或其他DNA定量方法定量回收的线性化DNA
引入要捕获到的靶DNA的来源。大肠杆菌 ElectroMAXDH10β细胞
对于以下方案，必须首先将靶DNA工程化为含有选择性标记以促进基于重组的捕获事件的选择。例如，Shigella 毒力质粒含有Kan ^R盒代替ipaJ （Reeves等人 2015）。
注意：
1. 如果需要去除抗生素抗性盒以用于下游应用，可以包括侧接抗生素抗性盒的FRT（FLP识别靶）位点，如Datsenko和Wanner（2000）中所述。可能通过重组捕获DNA的未标记区域，然而这里没有调查这种可能性。
2. 不是绝对必要的将DNA来源转移到 E。如果DNA来源存在于可以有效地进行λRed重组的细菌物种中，则可以使用大肠杆菌。然而，根据我们的经验，执行这一步骤大大提高了DNA捕获的效率和成功。
1. 通过电穿孔将标记的粘粒或毒力质粒转化到ElectroMAXDH10β细胞中，并在含有卡那霉素（或合适的抗生素抗性标记）的LB平板上选择。注意：只有使用这些商业上可获得的细胞，我们才成功地将大的220kb志贺氏菌属毒力质粒引入到实验室菌株E/E中。大肠杆菌。
使用λ红色重组系统捕获感兴趣的DNA序列（图2B）
1. 为了能够在靶细菌菌株中表达同源重组系统，首先通过标准电穿孔将质粒pKD46（Datsenko和Wanner，2000）引入菌株，并在含有氨苄青霉素和0.2％葡萄糖的固体培养基上进行选择（以抑制λRed表达）。
  注意：pKD46是温度敏感的氨苄青霉素抗性质粒，其在阿拉伯糖 - 诱导型启动子的控制下携带λ红色重组酶的等位基因。也可以使用编码λRed重组酶的其他质粒（Murphy和Campellone，2003）
  
  2.示意图说明如何使用捕获载体将目标DNA序列分离到酵母产生的捕获载体上。 A。捕获载体通过用PmeI和MluI消化而线性化，以产生对应于TS1和TS2 DNA的游离DNA末端，以增强重组效率并除去氨苄青霉素抗性盒。 B.线性化的DNA被引入 E。大肠杆菌 ="" 菌株，其含有编码含有可选择标记的靶dna序列的毒力质粒或粘粒;<=""> ie ie ，pKD46（未示出）。先前将抗生素选择标记引入靶DNA中有助于在DNA片段整合到捕获载体中之后选择DNA片段。 λRed重组酶的表达导致目标DNA通过同源重组（虚线）转移到线性化捕获载体上。

数据分析 >：确认将目标DNA片段转移到捕获载体上

我们建议使用几种补充方法来确认正确的靶DNA片段已转移到捕获载体上。根据我们的经验，接近100％的质粒从E中回收。携带两种抗生素标记的大肠杆菌含有正确的目标DNA片段

候选质粒应通过以下筛选正确的重组事件：

（即使用pLLXF或pLLXR寡核苷酸[表1和图1]的PCR）和合适的靶DNA寡核苷酸的PCR分析。

使用基因特异性引物对应当包括在DNA捕获区域中的序列进行PCR分析。应该包括阳性和阴性对照，例如，使用空捕获载体作为阴性对照的PCR模板，并且包含靶DNA区段的亲本细菌菌株作为阳性对照。

可以进行使用特异性结合起始毒力质粒或粘粒特异性区域但不存在于捕获的DNA区域中的引物的PCR反应，以证实亲本毒力质粒或粘粒的丧失。

使用靶基因特异性寡核苷酸，pLLXF或pLLXR对捕获的靶DNA进行序列分析。

第三部分：将目标DNA整合到细菌染色体上的着陆点位置

注意：

本部分描述了如何将来自捕获载体的大片靶DNA转移到含有着陆垫位点的细菌菌株的染色体中。在Kuhlman和Cox（2010）的方法论文中详细描述了将着陆点位点引入细菌染色体中，因此这里不讨论。因此，为了继续本方案的第III部分，需要含有整合着陆点位点的细菌菌株，例如大肠杆菌DH10β。

E。在atp/gidB基因座处具有整合着陆点位点的大肠杆菌DH10β可在Addgene，目录号：83036获得。着陆点位点还将四环素抗性盒引入染色体中（图3）。

制备用于将捕获的靶DNA整合入染色体中的着陆区位点的细菌菌株注意：

为了将靶DNA转移到细菌染色体的着陆点位点，捕获的靶DNA质粒必须含有通过巢式PCR引入的侧翼着陆序列（参见第I部分和图1B）。

着陆垫宿主菌株必须含有两个质粒：（1）含有捕获的靶DNA序列（在第II部分中产生和证实）的pLLX13捕获载体和（2）pTKred，一种壮观霉素抗性的温度敏感性质粒， IPTG驱动的λ红色重组酶和阿拉伯糖驱动的SceI限制性内切核酸酶。该方案使用在atpI/gidB基因座具有着陆点位点的大肠杆菌DH10β。如果捕获的靶DNA质粒（来自部分II）已经被引入到部分II中的大肠杆菌DH10β-着陆垫中，则通过直接进入步骤B（将pTKred质粒引入大肠杆菌中）将pTKred引入菌株中开始该方案含有捕获的靶DNA的DH10β-着陆垫细菌）。

将含有靶DNA的捕获载体质粒导入EM。大肠杆菌DH10β-着陆垫细胞

第1天：接种单个四环素抗性的E。大肠杆菌DH10β-接合垫菌落到含有四环素的LB肉汤中，并在37℃的滚筒上生长过夜。

第2天：早上，向后稀释 E。大肠杆菌DH10β-着陆垫细菌1:100加入含有四环素的10ml LB肉汤中。在滚筒或摇动器上在37℃下孵育约1-2小时，直到培养物达到0.6的OD 600。

生成电子能力。大肠杆菌DH10β-着陆垫细胞：

在冰上孵育细胞1小时。

将细胞转移到无菌瓶中，并在6,000×g离心10分钟，在4℃。

滗析上清液和重悬细菌在5毫升冰冷的10％甘油。
注意：在整个过程中，通过将管子放在冰上的洗涤步骤之间，让细菌沉淀冷。

在6,000xg下重复离心10分钟。

倾析上清液并重复10％甘油洗涤3次以上，共4次洗涤注意：如果需要，4次洗涤可以用冰冷的无菌水代替10％甘油进行。

将最终沉淀重悬在200μl冷的10％甘油中。

将100μl电感受态细胞转移到新的微量离心管中

加入200ng含有捕获的靶DNA的质粒（图2B），并将细菌细胞和DNA的混合物转移到0.1mm比色杯中。

使用GenePulser II（Bio-Rad Laboratories）或等效电穿孔装置根据制造商的设置进行电穿孔。

添加450微升SOC肉汤到电穿孔的细胞，并转移到微量离心管

在37℃下在加热块或水浴中孵育细胞1小时

在含有四环素（以选择染色体上的着陆点位点）和卡那霉素或合适的抗生素（以选择捕获的靶DNA的区域）的LB平板上铺板整个转化，并在37℃下孵育过夜。

将pTKred质粒导入em。大肠杆菌DH10β-着陆垫细菌含有捕获的目标DNA

第1天：接种单个菌落的四环素/卡那霉素抗性E。将含有捕获的靶DNA质粒的大肠杆菌DH10β-着陆垫细菌加入含有四环素和卡那霉素的LB肉汤中，并在37℃的滚筒上生长过夜。

第2天：早上，背部稀释 E。将含有捕获的靶DNA质粒1:100的大肠杆菌DH10β-着陆垫细菌加入到10ml含有四环素和卡那霉素的LB肉汤中。在滚筒或摇动器上在37℃下孵育约1-2小时，直到培养物达到0.6的OD 600。

生成电感受态细胞

在冰上孵育细胞1小时。

将细胞转移到无菌瓶中，并在6,000×g离心10分钟，在4℃。

滗析上清液和重悬细菌在5毫升冰冷的10％甘油。
注意：在整个程序中，通过将管置于冰之间的洗涤步骤之间保持细菌沉淀冷。

在4℃下，以6000xg重复离心10分钟。

倾析上清液并重复10％甘油洗涤3次以上，总共4次洗涤。
注意：如果需要，4次洗涤可以用冰冷的无菌水代替10％甘油进行。

加入100 ng pTKred质粒，并将细菌细胞和DNA的混合物转移到0.1 mm比色皿中。

使用GenePulser II（Bio-Rad Laboratories）根据制造商的设置的等效电端口装置进行电穿孔。

添加450微升SOC肉汤到电穿孔的细胞，并转移到微量离心管

孵育细胞在30℃下1小时。
注意：pTKred对温度敏感，因此必须在30℃下进行生长和电镀。

在含有四环素（以选择染色体上的着陆点），卡那霉素（以选择捕获的靶DNA质粒），壮观霉素（选择pTKred）和0.2％D-葡萄糖（抑制表达λRed重组酶）并在30℃下孵育过夜。

将目标DNA插入染色体上的着陆垫
注意：

协议的这部分修改从Kuhlman和Cox（2010）。在该步骤中，使用阿拉伯糖诱导SceI限制酶的表达，而IPTG诱导λRed重组酶的表达。 SceI在着陆垫整合的位点处将双链DNA断裂引入大肠杆菌DH10β染色体中。同时，SceI在捕获的靶DNA质粒上引入双链DNA断裂。 λRed重组酶的表达导致染色体上的着陆位点和存在于靶DNA的游离末端的那些之间的同源重组。成功的SceI消化和同源重组导致染色体的双链断裂修复，四环素盒的切除和靶DNA序列在其位置的整合（图3）。双链断裂的引入产生DNA的游离末端，大大增加同源重组的效率。

18bp SceI限制性识别位点不自然存在于大肠杆菌染色体中。

第1天：早上，用单一集落的E接种5ml含有0.5％甘油，2mM IPTG和0.2％阿拉伯糖的SOB肉汤。含有捕获的靶DNA质粒和pTKred的大肠杆菌DH10β-着陆垫菌株。在滚筒或摇床上在37℃下生长1小时

向肉汤中加入5μl壮观霉素（100mg/ml），并在滚筒或振荡器上在30℃下孵育4小时。

向肉汤中加入5μl卡那霉素（100mg/ml），并在滚筒或振荡器上在30℃下孵育过夜。

第2天：在10℃-1至10℃下在LB肉汤中进行系列稀释的过夜培养物，并将100μl细胞铺板于含有卡那霉素的LB平板上。 >

在37℃下孵育平板过夜

第3天：将含卡那霉素抗性菌落铺在含有四环素和含有卡那霉素的LB平板的LB平板上，筛选已成为四环素易感的菌落。

在37℃下孵育平板过夜。

具有卡那霉素抗性和四环素敏感性的菌落是在着陆点位点成功靶DNA整合的候选物。（即存在于染色体上的四环素抗性盒已被靶DNA序列替代）。
注意：在37℃下孵育也应该消除温度敏感的pTKred质粒。 pTKred的缺失可以通过将菌落接种到含有壮观霉素的LB平板上来确认。如果在37℃下生长不足以使pTKred质粒下降，则单个菌落可以在42℃下生长4小时或过夜，然后在37℃下再次接种到含有卡那霉素的LB平板上，然后重新测试壮观霉素敏感性。在较高温度下传代应当确保pTKred的损失。

数据分析 >：确认靶DNA整合到染色体着陆垫位点
可以通过以下方式分析个体集落中是否存在整合的靶DNA：

使用引物进行PCR分析以评估染色体中连接区域的整合。如果 E。使用大肠杆菌DH10β-着陆垫菌株，atpI/gidB F和atpI/gidB R寡核苷酸（图3和表1）可与靶基因特异性引物一起使用以评估连接。

使用引物进行PCR分析以评估整合菌株中预期靶DNA基因的存在或不存在。

如果合适，可以对整合的靶DNA基因进行功能分析

图3.说明靶DNA从捕获载体转移到在着陆点位点的细菌染色体中的示意图。捕获的靶DNA序列可以整合到细菌宿主菌株的染色体中，所述菌株含有集成着陆垫站点。着陆点位置1（LP1）和2（LP2）被示出为蓝色框。必须将两种质粒引入宿主菌株：（1）含有侧翼为着陆垫位点和SceI限制位点的靶DNA的捕获载体（见设计的第I部分和表1）和（2）pTKred，其编码IPTG诱导型λRed重组酶和阿拉伯糖可诱导的SceI限制性内切核酸酶（未示出）。用阿拉伯糖诱导SceI导致双链DNA断裂进入宿主菌株染色体和邻近着陆点位点的捕获的靶DNA上。然后通过IPTG诱导的λRed重组酶表达（虚线）通过同源重组连接DNA的游离末端。可以通过筛选卡那霉素抗性和四环素敏感性来鉴定含有靶DNA正确插入的细菌分离物，这表明来自染色体的着陆点间插序列和含有靶DNA的原始捕获载体都失去了。原始的1kb靶向序列1（TS1）由紫色框表示，靶向序列2（TS2）由红色框表示。原始的pLLX13同源序列表示为黑框。用atpI/gidB F或atpI/gidB R寡核苷酸（由箭头表示）（表1）和靶DNA特异性寡核苷酸的PCR分析可用于确认着陆点位点处的整合。

笔记

额外的应用：捕获染色体DNA的片段可以通过修改如Wolfgang等人所述的该方案来实现。（2003）。例如，捕获载体可以设计为包括与细菌染色体上的区域同源的靶向序列

DNA中的重复元件。在设计初始捕获载体靶向序列（TS1和TS2）时应该努力以确保1kb的靶序列是独特的，并且不包括重复元件或转座子序列，因为这可以影响λRed重组的特异性反应。

食谱

卡那霉素一硫酸盐（1,000x储备液）
30mg/ml在dH 2 O中，过滤除菌

氨苄青霉素钠盐（1,000x原液）
100mg/ml在dH 2 O中，过滤除菌

盐酸四环素（1,000x原液）
12.5mg/ml在100％甲醇中，过滤灭菌

壮观霉素二氢氯化物五水合物（1,000x原液）
100mg/ml在dH 2 O中，过滤除菌

CSM-URA选择性培养基（每升900 ddH 2 O）
6.7克酵母氮源与硫酸铵
0.77克CSM-URA，尿嘧啶缺失补充剂
〜20g琼脂
在倒板前加入100ml无菌20％葡萄糖

YEPD（每升ddH 2 O）
10g酵母提取物
20 g蛋白胨）
20克D-葡萄糖
〜15g琼脂

TE缓冲区
10mM Tris-HCl，pH8.0 1.0 mM EDTA

SOB肉汤（每升ddH 2 O）
5g酵母提取物
20克胰蛋白酶
0.584g NaCl
0.186克KCl
2.4g MgSO 4 使用前调整pH值为7.5

SOC肉汤（每升ddH 2 O）
向990ml SOB肉汤中加入10ml无菌20％D-葡萄糖溶液

致谢

该协议改编自Reeves等人。（2015）。工作由R01AI064285，R21AI103882和马萨诸塞州总医院研究学者奖2016支持到CFL。 AZR由MGH ECOR医学发现奖学金基金支持。

参考文献

Datsenko，KA和Wanner，BL（2000）。 One使用PCR产物在大肠杆菌K-12中染色体基因的步骤失活。 Proc Natl Acad Sci USA 97（12）：6640-6645。

Gietz，RD和Woods，RA（2002）。转型酵母通过乙酸锂/单链载体DNA /聚乙二醇法。方法Enzymol 350：87-96。

Kuhlman，TE和Cox，EC（2010）。网站 - 特异性染色体整合大合成构建体。核酸研究38（6）：e92。

Murphy，KC and Campellone，KG（2003）。 Lambda红介导的肠创伤和肠致病性E的重组工程化。大肠杆菌。 BMC Mol Biol 4：11.

Reeves，AZ，Spears，WE，Du，J.，Tan，KY，Wagers，AJand Lesser，CF（2015）。将大肠杆菌工程化为哺乳动物细胞的蛋白质递送系统。

ACS Synth Biol 4 （5）：644-654

Wolfgang，MC，Kulasekara，BR，Liang，X.，Boyd，D.，Wu，K.，Yang，Q.，Miyada，CG和Lory，S。（2003）。绿脓假单胞菌的临床和环境分离物中的基因组内容和毒力决定簇的保存。 Proc Natl Acad Sci USA 100（14）：8484-8489。