材料和试剂

针（25G）（Henke-Sass Wolf，目录号：4710005016）
新生大鼠（0-2天龄）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S0751）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S8875）
D-葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：AC410950010）
氢氧化钠（NaOH）（1N）（Sigma-Aldrich，目录号：795429）
盐酸（HCl）（37％）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
异氟烷（Piramal Enterprises，Piramal HealthCare，目录号：异氟烷）
凡士林（Sigma-Aldrich，目录号：16415）
人工脑脊液（aCSF）溶液（见Recipes）

设备

将Fisherbrand TM烧杯（1L）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：15449083）
冰桶（SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument，目录号：M18848-2001）
用于吸入麻醉的感应室（TemSega，目录号：室）
异氟烷蒸发器（TemSega，型号：异氟烷蒸发器）
Carbogen，95％O 2，5％CO 2（林德集团，Linde Gaz，型号：Carbogen B50）
手术刀（LCH MEDICAL PRODUCTS，目录号：SCX23）（图1a）
小剪刀（Moria，型号：MC26B）（图1a）
精细镊子（Fine Science Tools，Dumont，型号：55）（图1a）
解剖室（塑料盒，100毫升）与2毫米硅氧烷弹性体层
双目显微镜（Olympus，型号：SZX7）
由具有2mm硅氧烷弹性体层的标准培养皿（60mm）组成的记录室（10ml）
蠕动泵（Gilson，型号：Minipuls 3）

程序

人工脑脊液（aCSF）
有关准备，请参阅下面的"配方"部分中的说明。一旦准备好，将含有CSF的烧杯置于冰桶中。
脑干脊髓的解剖和隔离
1. 将新生大鼠（0-2天大）在诱导室吸入麻醉。用4％异氟烷麻醉动物，直到对尾巴收缩（在7至10分钟内）的反射反应性丧失。
2. 使用手术刀，通过断头术迅速安乐死（切口必须在耳朵前面进行）（图1b）。这允许只矫正到第五脑神经
3. 用镊子和剪刀去除覆盖在背部的皮肤和肌肉（图1c）
4. 将制剂转移到填充有aCSF在4℃的解剖室和插入针在每个前肢和后肢，以保持准备（轻微拉伸）与背面向上（图1d）。
5. 在双目显微镜下，用细镊子举起并举起颅骨。使用小剪刀，切两侧的颅骨，以暴露脑干（图1e）。
6. 沿着脊柱使用相同的程序，切割两侧的每个脊椎暴露脊髓（背椎板切除术）（图1f）。
7. 转动准备工作，以保持腹侧表面向上（图1g）。
8. 用细镊子握住并抬起颅骨（图1h），切除所有腹侧和背侧脊髓根，留下尽可能长的长度。图1h中的插图示出了如何去除皮肤，肌肉和骨骼以允许进行椎板切除术。为了避免损伤脑干和/或脊髓，至关重要的是不要用镊子抓住神经组织
9. 使用勺子，小心地转移脑干脊髓，其腹侧和背侧脊根仍然附着在含有循环aCSF（流速，3-5ml /分钟用蠕动泵调整）的10ml记录室（图1i）。
10. 为了确保机械稳定性，通过插入通过围绕脑干和脊髓的脑膜的多个销将制备物的腹侧表面向上钉住。
11. 为了评估该程序的质量，用填充有aCSF溶液的玻璃吸引电极记录脊髓腹根中的运动输出活动（图2a）。通过差分AC放大器（低截止，100Hz;高截止，1kHz）将信号（动作电位突发）放大（10,000次），数字化并通过模拟/数字接口获取，并最终存储在计算机上。当运动活动由孤立制剂自发产生时，解剖是成功的（图2b-2c）
  
  图1.脑干 - 脊髓剥离的示例。用于解剖的工具; b。新生大鼠（2日龄）和切口水平进行去脑; C。去牙后，去除覆盖背部的皮肤和肌肉; d-f。首先暴露脑干和脊髓的背侧表面; g和h。腹面;一世。图像显示孤立的脑干脊髓准备与其脊根仍然附加
  
  图2.来自体外新生大鼠准备的脊髓侧根中的运动输出活动。在记录室中的分离的脑干脊髓（来自P2新生动物）的图像。当需要时，记录室被隔开具有注射器喷射凡士林的屏障的2或3个区室，以允许所选脊髓区域的差异暴露于药物治疗。 b。同时记录从第四颈（C4）和第一腰椎（L1）腹侧根。呼吸样节律自发产生，显示清楚的吸气（Insp）C4和预吸气/呼气（pre-I; Exp）L1交替相。 C。盲法（使用尖锐或贴片电极）用于记录脑干和脊髓呼吸神经元的节律活动。这里，刺穿的神经元的发射与L1腹侧根部放电同步，因此被识别为呼气运动神经元（MN）。

数据分析

可以使用填充有aCSF溶液的玻璃抽吸电极记录脊髓腹根中的呼吸和运动相关活动。为这两个功能产生的电机输出包括节奏爆发活动，允许几种类型的分析。因此，通过记录呼吸运动输出（参见Giraudin等人，2008），可以确定药理学或损伤实验之前，期间和之后的呼吸频率。为了量化不同条件之间的呼吸节律的调节，使用专用软件（例如SigmaPlot 11.0（Systat））进行统计分析。结果表示为平均值±SEM（或SD）和Student's t检验用于比较两组的平均值，而重复测量ANOVA和随后的Tukey氏事后检验用于比较更多比两组。当 P ˂0.05时，差异被认为具有统计意义
还可以建立运动相关的爆发活动（例如呼吸相对于运动）或运动相对于运动爆发活动之间的相位关系。为了计算相位关系，选择给定腹侧根的几个爆发活动作为参考。通过将每个电动机输出的两个连续突发开始的开始之间的持续时间除以基准周期周期来计算第二腹侧根中的突发开始的相位值。然后将相位值绘制在具有从0到1的刻度范围的圆形相图上。接近0或1的相位值表示同步，而接近0.5的值反映交替。

食谱

人工脑脊液（aCSF）溶液

加入7.305g NaCl（终浓度100mM），0.249g KCl（4mM），0.069g NaH 2 PO 4（1.2mM），0.185g CaCl 2， 2mM（2mM），0.233g MgCl 2（1.3mM），1.764g NaHCO 3（25mM），5.406g D-葡萄糖（30mM））装入装有1L蒸馏水的烧杯中
用磁力搅拌器混合溶液
将烧杯置于冰桶中，在使用前用95％O 2和5％CO 2灌注aCSF至少30分钟
调节pH至7.4（使用NaOH或HCl）

致谢

该方案改编自我们发表的文章：Le Gal等人。（2016），J-P。 Le Gal和A. Nicolosi得到了法国"Ministèrede l'EnseignementSupérieuret de la Recherche"博士生的支持。作者感谢R. Anselm的意见和英语修订。

参考文献

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