材料和试剂

HIV-1颗粒的生产
1. 10cm板（100×20mm）（Corning，Falcon ，目录号：353003）
2. 15cm板（150×20mm）（Corning，Falcon ，目录号：353025）
3. 15 ml锥形管
4. 33mm Millex-HV注射器过滤器，PVDF，0.45μm（EMD Millipore，目录号：SLHV033RS）
5. 具有BD Luer-Lok 尖端（BD，Luer-Lok ^TM，目录号：309653）的60ml注射器
6. 50ml高清晰度PP离心管，锥形底，无菌，25 /袋，500 /箱（Corning，Falcon ，目录号：352070）
7. 293FT细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：R700-07）}
8. X4-HIV-Gag-iGFP质粒注意：衍生自HIV-1分子克隆NL4-3，其经修饰以如先前所述在Gag的MA和CA结构域之间插入GFP蛋白（Hubner等人，2007）。
9. Dulbecco对Eagles培养基（DMEM）的修饰（Mediatech，目录号：10-017-CV）
10. 胎牛血清（FBS）
11. MEM氨基酸溶液（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30598.01）
12. HyClone TM L-谷氨酰胺（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH3003401）
13. HyClone 青霉素链霉素100x溶液（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SV30010）
14. 庆大霉素（50mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15750060）
15. 遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（粉末）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11811023）
16. 胰蛋白酶0.05％蛋白酶溶液与猪胰蛋白酶，HBSS，EDTA;无钙，镁（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30236.01）。
17. ProFection 哺乳动物转染系统 - 磷酸钙（Promega，目录号：E1200）
18. 氯化钙（CaCl 2）
19. 100mM丙酮酸钠溶液（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30239.01）
20. 1 M HEPES溶液（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30237.01）
21. D10介质（见配方）
单核细胞衍生的树突细胞（MDDC）的分化
1. 具有BD Luer-Lok 尖端（BD，Luer-Lok ^TM，目录号：309653）的60ml注射器
2. 针（50/sp，500/ca），18G×1/2英寸（BD，SafetyGlide ^TM，目录号：305918）
3. 3ml塑料一次性转移（Pasteur）移液管，20s无菌（Elkay Laboratory Products，Liquipette ，目录号：127-P503-20S）
4. 40μm尼龙细胞过滤器
5. LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
6. 10cm板（100×20mm）（Corning，Falcon ，目录号：353003）
7. 50毫升来自纽约血液中心的白细胞层（白血病）
8. Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare，HyClone ，目录号：17-1 440-02）
9. 不含钙，镁，酚红的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30028.02）
10. 牛血清白蛋白（BSA），级分V，热休克（Roche Diagnostics，目录号：03116956001）
11. EDTA
12. RPMI 1640培养基（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30096.01）
13. 胎牛血清（FBS）
14. 1 M HEPES溶液（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30237.01）
15. 2-巯基乙醇（55mM）（1,000x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：21985-023）}
16. HyClone TM L-谷氨酰胺（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH3003401）
17. HyClone 青霉素链霉素100x溶液（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SV30010）
18. 遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（粉末）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11811023）
19. 抗人CD14微珠
20. 20.人GM-CSF（Affymetrix，eBioscience，目录号：34-8339-82）
21. 人IL-4（Affymetrix，eBioscience，目录号：34-8049-82）
22. 抗hDC-SIGN PE（克隆：120507），小鼠IgG2B（R& D Systems，目录号：FAB161P）
23. 抗hCD14 APC（克隆：61D3）（Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0149-42）
24. MACS缓冲区（参见配方）
25. DC介质（参见配方）
MDDC加载HIV-1或葡聚糖
1. 96孔透明的圆底TC-处理的细胞培养微板，带有盖，单独包装，无菌（Corning，目录号：353077）
2. X4-HIV-Gag-iGFP质粒注意：衍生自HIV-1分子克隆NL4-3，如先前所述（Hubner等人，2007）修饰以将GFP蛋白插入Gag的MA和CA结构域之间
3. 葡聚糖，荧光素（10,000MW，阴离子，赖氨酸可固定）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：D-1820）
4. 葡聚糖，荧光素（70,000MW，阴离子，赖氨酸可固定）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：D-1822）
5. 葡聚糖，荧光素（500,000MW，阴离子，赖氨酸可固定）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：D-7136）
6. 葡聚糖，荧光素（2,000,000MW，阴离子，赖氨酸可固定）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：D-7137）
7. 不含钙，镁，酚红的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30028.02）
8. MACS缓冲区（参见配方）
通过流式细胞术分析HIV-1或葡聚糖捕获
1. Hanks平衡盐溶液（HBSS）（1x）（Mediatech，目录号：21-023-CV）
2. LIVE/DEAD 可固定的蓝色死细胞染色试剂盒（用于UV激发）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：L23105）
3. 抗hDC-SIGN PE（克隆：120507），小鼠IgG2B（R& D Systems，目录号：FAB161P）
4. 抗hCD14 APC（克隆：61D3）（Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0149-42）
5. 固定/渗透溶液试剂盒（RUO）（固定/渗透溶液125ml和BD Perm/Wash TM缓冲液100ml）（BD，Cytofix/Cytoperm TM，目录号： 554714）
6. 抗-P24 KC57-RD1（Beckman Coulter，目录号：6604667）
通过定量PCR（QPCR）对HIV-1捕获的分析
1. 白色（Roche Diagnostics，目录号：04729692001）的LightCycler 480多孔板96.
2. LightCycler 480 SYBR Green I Master（Roche Diagnostics，目录号：04887352001）
3. TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：15596-018）
4. SuperScript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18080-051）
5. 引物：
  GFP正向：5'-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3'
  GFP反向：5'-AAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3'
  GAPDH正向：5'-CCCATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'
  GAPDH反向：5'-GAGATGATGACCCTTTTGGCTCC-3'
通过共聚焦显微镜分析HIV-1或葡聚糖捕获
1. （Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-552-5）的Fisherbrand TM显微镜载玻片（25×75×1.0mm，双磨砂预清洗）
2. 盖玻片，圆形，5mm直径，＃1 0211玻璃（Corning，Falcon ，目录号：CLS-1763-005）
3. 聚-L-赖氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P8920-100ML）
4. 多聚甲醛，16％溶液，EM级（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
5. PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）（Sigma-Aldrich，目录号：P6757-100G）
6. EGTA [乙二醇 - 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸四钠盐，≥97％]（Sigma-Aldrich，目录号：E8145-10G）
7. 硫酸镁（MgSO 4）
8. 氢氧化钾（KOH）
9. TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-100ML）
10. 5％酪蛋白溶液，如在Dustin等人中描述和制备的。（2007）
11. 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：D1306）
12. 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）（Sigma-Aldrich，目录号：D27802-25G）
13. 聚（乙烯醇）（PVA）（Sigma-Aldrich，目录号：341584-25G）
14. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516-100ML）
15. Tris缓冲液，pH8.7（1.5M）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610798）
16. 2x PHEM缓冲液（参见配方）
17. DABCO-PVA（参见配方）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5810）
涡流
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Heracell ^TM 240）
流式细胞仪（BD，型号：LSRII），这链接到HTS模块，而不是LSRII
高通量取样器（HTS）（BD）
QPCR系统（Roche Diagnostics，型号：LightCycler 480）
共焦显微镜（Zeiss，型号：LSM 710）

软件

ImageJ软件

程序

HIV-1的生产
注意：HIV-1颗粒是在293FT细胞中磷酸钙转染后产生的。
1. 293FT细胞培养
  1. 在500μg/ml的Geneticin存在下，将293FT细胞在10cm平板中的D10培养基中培养。
  2. 当接近汇合时，将细胞胰蛋白酶化（0.05％胰蛋白酶），通过离心（475×g，在4℃下5分钟）洗涤，并在1/5稀释后铺板在10cm平板中。
  3. 板8×10 6/15/15cm平板，293FT细胞在转染前一天在30ml不含Geneticin的D10培养基中。
  4. 一个15厘米板将产生20毫升病毒，所以转染实验应相应地缩放。
  注意：为了最大化病毒颗粒的产生，293FT细胞在培养过程中永远不会超过3周（3周后，总是回到冷冻的起始等分试样）。
2. 磷酸钙转染
  注意：Promega试剂盒用于磷酸钙转染。描述了用于在一个15cm平板中转染的转染方案。
  1. 在15ml锥形管（试管1）中用1.12ml无核酸酶的H 2 O 2稀释60μgDNA（X4-HIV-Gag-iGFP）。
  2. 向稀释的DNA中加入168μlCaCl 2，2M，
  3. 在另一个管（管2）中，加入1350μl的2x HEPES缓冲盐水（2x HBS）
  4. 在轻轻涡旋管2的同时，将制备的DNA溶液滴加到管2中的HBS
  5. 将溶液在室温下孵育30分钟
  6. 在将转染溶液加入细胞之前再次涡旋转染溶液
  7. 在板周围的各个位置滴加含有DNA-CaCl 2 HBS的溶液。
  8. 旋转板以均匀地分布溶液。
  9. 转染后20小时，用20ml不含G418的D10培养基小心地更换培养基
  10. 培养基更换后24小时，收获上清液
  11. 用0.45μm无菌过滤单元用PVDF膜过滤上清液两次（以除去细胞和碎片）
  12. 过滤的病毒上清液可以新鲜使用或储存于-80℃
单核细胞衍生的树突细胞（MDDC）的分化
1. 获得外周血单核细胞（PBMC）。使用从纽约血液中心订购的血沉棕黄层，使用Ficoll-Paque分离介质的单核细胞分离获得PBMC。
2. 使Ficoll和DPBS达到室温（RT）
3. 使用60毫升注射器和18 G厚的针从血沉棕黄层中恢复血液
4. 将血液与RT DPBS（1:1比例）混合
5. 使用针头加入25毫升稀释的血液到已经含有15毫升Ficoll的50毫升Falcon管
6. 在845×g离心30分钟，RT，并且制动关闭。
7. 用塑料移液管回收白色白细胞层（黄色血清和红色血小板层之间）。
8. 用冷的DPBS洗涤含有PBMC的白细胞层，在4℃下以170×g离心10分钟（缓慢旋转以除去血小板）。
9. 将细胞重悬在MACS缓冲液中，洗涤，在475℃下旋转，在4℃下5分钟。
10. 计数单元格。
11. 每100万个PBMC加入50μl来自Miltenyi的抗人CD14微珠和950μlMACS缓冲液。
12. 在4℃孵育20分钟。
注意：在用抗CD14磁珠染色PBMC时，总是在冰箱中而不是在冰上染色，以防止抗体的上限效应。

在MACS缓冲液中洗涤，然后在475℃下旋转，在4℃下5分钟。
重悬于5ml MACS缓冲液中，并使用40μm尼龙细胞滤器过滤
通过LS MACS分离柱运行样品进行阳性选择
使用3ml MACS缓冲液进行LS柱的3次洗涤
通过使用5毫升MACS缓冲液和柱塞从柱中恢复CD14 ⁺细胞。
计数细胞，并在具有hGM-CSF（10ng/ml）和hIL-4（50ng/ml）的DC培养基中以1百万/ml的浓度平板。
注意：为了获得关于单核细胞分化成MDDC的最佳结果，在20mL DC培养基中，每10cm平板接种2000万单核细胞。
分离后2天，加入40％的具有hGM-CSF（10ng/ml）和hIL-4（50ng/ml）的新DC培养基。
分离后4天，通过流式细胞术检查MDDC分化：监测DC-SIGN的上调和CD14的下调（两种抗体的1/200的储备溶液）。

MDDC加载HIV-1或葡聚糖
1. 在U底96孔板中每孔加入50,000个MDDC（1百万/ml）。
2. 将96孔板放在冰上，同时加入艾滋病毒1或葡聚糖分子，同步捕获
3. 加入50ng的HIV-1或100μg/ml的各种大小的FITC标记的葡聚糖分子（10kDa，70kDa，500kDa，2,000kDa）。
  注意：不要忘记添加阴性对照：没有病毒或葡聚糖和/或细胞保持在4°C。
4. 在37℃，5％CO 2孵育4和24小时HIV-1和30分钟和4小时葡聚糖分子。
5. 温育后，通过加入200μl冷DPBS广泛洗涤，并在4℃离心5分钟，475×g。
6. 重复洗涤步骤3次。
7. 分析HIV-1或葡聚糖捕获
通过流式细胞术分析HIV-1或葡聚糖捕获
1. 对于流式细胞术分析，取带有葡聚糖或HIV-1的细胞
2. 用50μl在HBSS（1x）（1/500）中稀释的活/死蓝可固定染料在冰上染色15分钟。
3. 使用MACS缓冲液（475×g）洗涤，5分钟，4℃
4. 用抗hDC-SIGN-PE（在MACS缓冲液中稀释1/200）和抗hCD14-APC（在MACS缓冲液中稀释1/200）染色以控制MDDC分化。
5. 孵育30分钟，4℃，盖上
6. 使用MACS缓冲液（475×g）洗涤，5分钟，4℃
7. 重悬于100μl。
8. 对于葡聚糖检测，不需要进一步染色。对于HIV-1检测，需要使用50μlBD Cytofix/Cytoperm ^TM，在4℃下20分钟固定细胞。
9. 使用100μl的BD Perm/Wash缓冲液洗涤
10. 使用抗P24-RD1，在BD Perm/Wash缓冲液中1/500稀释的HIV-1衣壳的染色。室温下1小时。
11. 使用MACS缓冲液（475×g）洗涤，5分钟，4℃
12. 重悬于100μl。
13. 继续流式细胞术分析。
  注意：对于流式细胞术，可使用BD高通量取样器（HTS）运行96孔板。
通过定量PCR（QPCR）对HIV-1捕获的分析
使用Roche LightCycler 480和Roche 480 SYBR Green I Master试剂根据制造商说明书在逆转录后进行实时定量PCR（qPCR）。使用标准曲线，基于GFP mRNA（病毒编码GFP）的量计算HIV的相对丰度，并使用GAPDH作为对照进行标准化。</i>
1. 使用TRIZOL RNA分离方案从3×50,000个MDDC中提取总RNA。
2. 使用SuperScript ^{III第一链合成系统在20μl最终反应体积中逆转录5μlRNA。}
3. 对于每个样品，将2μl稀释的cDNA（在水中稀释，1/2和1/5）用于QPCR反应
4. QPCR混合：
  6μl2x SYBR Green混合物
  0.6μl引物F（10μM）
  0.6μl引物R（10μM）
  2.8μlH 2 O x/b 2μlcDNA
5. QPCR反应：
  步骤1：95℃，5分钟
  步骤2：95℃，5秒
  步骤3：60℃，30秒
  步骤4：72℃，20秒
  返回步骤2，50个周期
6. QPCR分析：基于标准曲线，确定GFP mRNA量并通过GAPDH在每个样品中归一化
通过共聚焦显微镜分析HIV-1或葡聚糖捕获（图1和图2）
1. 将装有HIV-1或葡聚糖的MDDC放在预先用聚-L-赖氨酸溶液包被的盖玻片上，在37℃下孵育30分钟。
2. 在室温下在PBS-1％BSA中进行鬼笔环肽染色（以检测皮层肌动蛋白）或任何细胞表面染色30分钟（图2）。
3. 对于固定，在PHEM缓冲液中温热的多聚甲醛A（PFA）（2％）在室温下孵育10分钟。
4. 在0.1％Triton X-100中在PHEM缓冲液中稀释5分钟，在室温下渗透
5. 在5％酪蛋白溶液中进行封闭，在4℃下进行1小时
6. 对于细胞内染色（如果需要），将抗体在5％酪蛋白溶液中稀释并在室温下温育1小时。
7. 对于核检测，然后在室温下用DAPI（在H 2 O中以5mg/ml的储备液稀释1/5,000稀释）将细胞染色。（图1和2）。
8. 在PBS-0.1％BSA中洗涤5次（每次200μl）后，将细胞安装在自制的DABCO-PVA培养基中。
9. 使用共聚焦显微镜，为每个细胞分析内化GFP或FITC的强度，其分别代表捕获的HIV-1颗粒和葡聚糖分子。为此，获得400 nm Z堆叠，并确定艾滋病毒1和葡聚糖分子。 HIV-1和葡聚糖摄取的定量将在数据分析部分讨论。（图1和图2）
  
  图1.用100μg/ml 10kDa FITC标记的葡聚糖分子装载4小时的未转导和未处理的MDDC的实施例。在左图（亮视野）上可以看到盖玻片上的细胞。在右面板上，显示400nm的一个Z-堆叠部分，其中细胞的细胞核用DAPI（蓝色）染色，葡聚糖分子可以用绿色可视化。
  
  图2.通过共聚焦显微镜检查HIV-1内化的实施例 MDDCs未转导（上图）或用针对DNM2的shRNA转导（下图），用50ng HIV-1（绿色点）。明场可以在左面板上看到。在右面板上，显示400nm的一个Z-堆叠部分，其中细胞的核用DAPI（蓝色）染色，红色的肌动蛋白细丝，在鬼笔环肽染色后和捕获的HIV-1以绿色。

数据分析

通过流式细胞术分析HIV-1或葡聚糖捕获（图3）
1. 首先，门必须设置在活细胞上，通过排除已经结合活/死染色的细胞。重要的是MDDC是高度分化的，如通过DC-SIGN的高表达和CD14的低表达所评估的。（图3A）
2. 单核细胞通常是CD14高和DC-SIGN低。
3. 可以通过比较平均荧光强度（MFI）与阴性对照并确定样品之间的内在化比率来计算HIV-1或内含的葡聚糖的量（图3B）。
4. 建议通过使用不同的稀释度和不同的孵育时间来评估HIV和葡聚糖捕获，以获得代表性的和更准确的曲线。
5. 每个样品通常一式三份进行分析，并且用来自至少3个独立的健康献血者的细胞进行实验。
6. 样品之间MFI差异的统计分析可以使用Holm-Sidak多重比较检验进行单向ANOVA（NS，不显着; * P <0.05; ** P <0.01; ***
  <0.001; **** P <0.0001）。
  
  图3.通过流式细胞术分析HIV-1和葡聚糖捕获 A.分析MDDC的门控策略：左图，基于大小（FSC）和粒度（SSC）选通MDDC;对活化分化的MDDC（DC-SIGN +; dapi-）的右面板门控。 B.在装载有HIV-1（上图）或葡聚糖（下图）的MDDC上门控后产生的直方图的实例。在灰色中，P24的同种型对照用于评估由scramble shRNA相对于TSPAN7 shRNA转导的MDDC捕获的HIV-1的量。对于葡聚糖内化，灰色直方图表示阴性对照，其中细胞保持在4℃以防止内化。
通过定量PCR（QPCR）分析HIV-1捕获（图4）
1. 在逆转录后，通过使用用于GFP（编码在HIV基因组内部）的引物的定量PCR检测HIV-1RNA的量，并归一化为GAPDH。
2. 为了以最准确的方式评估数量，每个实验应包括使用GFP引物和GAPDH引物的标准曲线。
3. 然后使用标准曲线来确定每个样品中内化的HIV的量，并将其与阴性对照（在4℃下没有进行病毒或捕获实验）进行比较。
4. 可以在不同样品之间比较标准化的HIV-1数量，以评估HIV捕获的增加或减少（图4）。
5. 由于可能存在于不同血液供体之间的实验变化，优选不比较来自不同供体的样品，而是在趋势方面寻求供体之间的一致性。实验应该一式三份，并在至少五个不同的献血者。
6. 可以使用Holm-Sidak多重比较检验，根据单因素方差分析（one-way ANOVA）（NS，不显着; * P <0.05; P <0.01; ***
  <0.001; ****
  <0.0001）
  
  图4.通过定量PCR分析HIV-1捕获。在HIV捕获实验后通过定量PCR分析直方图的实例。用scramble shRNA转导的MDDC，空载体或针对TSPAN7的shRNA加载HIV-GFP 4或24小时。通过针对GFP的PCR分析捕获的HIV-1的量，并与scramble shRNA（任意设置为1）之后捕获的量进行比较。
通过共聚焦显微镜分析HIV-1或葡聚糖捕获（图5）
1. 对于通过共聚焦显微镜的葡聚糖内化的定量，我们使用鬼笔环肽染色（对于丝状肌动蛋白）以鉴定每个细胞的外部边界。
  1. 使用ImageJ软件，为每个Z-堆叠收集每个像素的葡聚糖的最大强度。
  2. 然后获得葡聚糖的总强度并归一化为所分析的体积。
  3. 积分强度可以通过取每个强度大于背景（强度≥200）的所有体素的总和，然后乘以强度和求和来计算。
  4. 通过计数大于背景的所有体素获得体积。
  5. 浓度是积分强度除以体积（任意单位）（图5）。
  6. 对于每个样品，我们建议计算至少100个细胞的葡聚糖的浓度并且用至少3个不同的人血液供体重复实验。未配对的 t 测试可用于确定统计显着性
2. 关于HIV-1内化的定量，使用共聚焦显微镜获得400nm Z-堆叠，每个细胞平均具有20个Z-堆叠。
  1. 基于其与皮层肌动蛋白屏障（鬼笔环肽染色）相比，每个HIV-1颗粒（绿点）可以手动计数为内化。
  2. 基于电子显微镜数据，估计每个HIV-1聚集体存在5个HIV病毒颗粒的平均值。
  3. 对于每个细胞，因此可以计算HIV-1的总量，并且分析每个样品至少100个细胞的平均值。未配对的 t 测试可用于确定统计显着性
    
    图5.通过共聚焦显微镜检查的葡聚糖捕获的分析。用针对TSPAN7的scramble shRNA或shRNA转导的MDDC用10kDa（左图）或70kDa葡聚糖分子（右图）培养4小时，。然后如上所述测定由每个MDDC内化的葡聚糖的浓度。简言之，浓度是葡聚糖染色的积分密度除以体积，并且在y轴上以任意单位显示。对于每个条件，每个点表示不同的单元格，平均值以±SEM显示

笔记

一般来说，当使用人类原代细胞时，您需要确保具有内部控制，以便能够标准化数据和比较来自不同献血者的数据。也可以观察到捐赠者对捐赠者的变化，并且增加不同的人类献血者的数量通常有助于更好地分析数据。
我们建议始终检查MDDC的成熟状态。该方案中描述的实验使用未成熟的MDDC进行。一旦成熟，就HIV-1捕获和葡聚糖内化而获得的结果是不同的。通过流式细胞术观察CD86和CD80分子可以确定成熟状态。不成熟的MDDC应该是CD80和CD86低。
所有3种技术测量MDDC的HIV-1内化。组合3种不同的方法增加了检测甚至捕获和内化中的小差异的机会，并且增加结果的鲁棒性。为了检测HIV-1内化的变化，流式细胞术可能不是最好的方法，因为它似乎没有像QPCR或共聚焦显微镜检测小量的艾滋病毒内部化敏感。定量PCR可能是最快和最简单的方法，但不允许直接比较HIV-1和葡聚糖内化，并且任何伪影污染可能潜在地偏差数据。最苛刻的技术可能是共焦显微镜，但允许在不同的样品之间的HIV-1和葡聚糖内化的最严酷的比较。

食谱

D10媒介
DMEM
10％胎牛血清（FBS，热灭活） 0.1 mM MEM非必需氨基酸
6mM L-谷氨酰胺 1mM MEM丙酮酸钠 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素 50μg/ml庆大霉素
MACS缓冲区
DPBS
0.5％牛血清白蛋白（BSA）
1mM EDTA
DC介质
RPMI
10％FBS（热灭活） 10mM Hepes（Hyclone）
55μMβ-巯基乙醇 6mM L-谷氨酰胺 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素 50μg/ml庆大霉素
2×PHEM缓冲液（500ml）
18.14克PIPES
6.5 g HEPES
3.8 g EGTA
0.99g MgSO 4 用10N KOH调节pH至7.0
DABCO-PVA
2.5％Dabco
10％聚乙烯醇（PVA） 5％甘油 25mM Tris缓冲液，pH8.7

致谢

我们感谢Alice F. Liang，Michael Cammer和NYULMC OCS显微镜核心为光学显微镜提供的服务;林文林技术帮助;和Jarrod Johnson，Nicolas Manel，他们的批评性建议。这项工作得到了来自EMBO，癌症研究所和Philippe基金会（M.M.M.）的研究金的支持;由霍华德休斯医学研究所（D.R.L.）和海伦和马丁·金梅生物和医学中心（D.R.L.）;和国立卫生研究院（R21AI084633）（D.R.L.）和NCRR（S10RR023704-01A1）的赠款。

参考文献

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Hubner，W.，Chen，P.，Del Portillo，A.，Liu，Y.，Gordon，RE and Chen，BK（2007）。 1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的序列Gag定位和寡聚化用复制能力的荧光标记的HIV的活共聚焦成像监测-1。 J Virol 81（22）：12596-12607。

Menager，MM和Littman，DR（2016）。肌动蛋白动力学调节树突细胞介导的HIV-1转移到T细胞。细胞 164（4）：695-709。