材料和试剂

6孔细胞培养板（Corning，Costar ，目录号：3516）
正常人成纤维细胞（IMR-90）（ATCC，目录号：CCL-186）
DMEM
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：26140095）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml，10,000μg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
两性霉素B（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15290018）
RPMI 1640培养基，无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11835030）
DPBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14190144）
NP-40
氯化钠（NaCl）
蛋白酶抑制剂片剂（Sigma-Aldrich，目录号：11836170001）
磷酸酶抑制剂（EMD Millipore，目录号：524625）
α-SMA抗体（American Research Products，目录号：03-61001）
β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A5441）
吐温20
成纤维细胞培养基（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

细胞培养温箱，37℃，5％CO 2：95％空气气氛（Thermo Fisher Scientific，Forma TM，型号：Direct Heat CO 2， sub>孵化器）

程序

种子成纤维细胞以1×10 6个/孔的密度接种在6孔细胞培养板中，总体积为1ml。允许细胞粘附到细胞培养板（2-6小时）。
收获小鼠的支气管肺泡灌洗液（BAL）（Han和Ziegler，2013）。可以用博莱霉素（1.75U/kg）或盐水作为阴性对照处理小鼠。确定支气管肺泡灌洗液（BAL）的蛋白质浓度。使用RPMI 1640培养基，将所有BAL样品标准化至相同蛋白质浓度，总体积为1ml。
注意：

通过免疫印迹分析确定α-SMA表达。通过使用20μg总细胞蛋白的Western印迹测定α-SMA蛋白的表达。在5％牛奶中封闭后，使用在含有0.1％Tween 20的Tris缓冲盐水中的1:3,000稀释液，用小鼠α-SMA一抗探测膜，将膜与抗小鼠二抗（1:2000）在抗体稀释缓冲液中1小时。

数据分析

结果可以显示为代表性的免疫印迹（图1）;也见Larson-Casey等人。（2016）。

图1.在来自盐水或博来霉素（Bleo）暴露的WT小鼠的BAL液（BALF）中培养的IMR-90成纤维细胞中α-SMA的免疫印迹分析

食谱

致谢

这项工作由2R01ES015981& VA优点评论BX001135。

参考文献

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Sime，PJ，Xing，Z.，Graham，FL，Csaky，KG和Gauldie，J。（1997）。