材料和试剂

1.5 ml Eppendorf管
15 ml锥形管
具有0.4μm透明PET膜（Corning，Falcon ，目录号：353090）的细胞培养插入物
70μm尼龙细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352350）
50ml锥形管
6孔板
0.2μm滤光片（BD）
8孔培养载玻片（Corning，Biocoat ^TM，目录号：354632）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（GE Healthcare，Hyclone ，目录号：SH30243.01）
来自Clost 溶组织um剂（Sigma-Aldrich，目录号：C9407-100MG）的胶原酶
Neurobasal 培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21103-049）
B-27 补充（50x），无血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17504-044）
GlutaMax ^TM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050-061）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml，10,000μg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140-122）}
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P6407-5MG）
层粘连蛋白（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：23017-015）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（GE Healthcare，Hyclone ，目录号：SH30256.01）
红细胞裂解缓冲液（QIAGEN，目录号：158904）
10％FBS（GE Healthcare，Hyclone ^TM，目录号：SH30919.03）
腺苷3'，5'-环状单磷酸酯，N 6 6 - 叔丁基2'-丁基 - 钠盐（db-cAMP;100μM）（EMD Millipore，Calbiochem。 sup>®，目录号：28745）
米诺环素（Sigma-Aldrich，目录号：M9511）
多聚甲醛-13 C（Sigma-Aldrich，目录号：604380）
正常山羊血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：16210072）
Triton X-100（DAEJUNG CHEMICAL& MITALS，目录号：8566-4405）
山羊抗小鼠IgG（H + L）第二抗体，Alexa Fluor？594缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A11005）}
抗βIII微管蛋白（Tuj-1）（Promega，目录号：G7121）
神经元培养基（见配方）
巨噬细胞培养基（参见配方）

设备

细剪
细镊子
血细胞计数器（Marienfeld-Superior）
解剖立体显微镜（Carl Zeiss，型号：Stemi DV4）
细胞培养CO 2培养箱（Panasonic）
扭动振动器（FINEPCR，型号：Twist shaker Tw3t）
台式离心机（Sorvall）
移液助剂
共聚焦显微镜（Olympus，型号：IX71）

软件

ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij/index。 html ）

程序

成年DRG神经元获自成年C57BL6小鼠。在处死动物后，解剖皮肤和椎旁肌肉以暴露脊柱。从S1到C1水平的双侧背根神经节（DRG）使用细剪刀和钳子在解剖显微镜下新鲜地解剖并浸泡在新鲜的冷DMEM中。确保在从根和神经分离DRG时小心不要损伤DRG。
注意：尽快解剖DRG非常重要。从一只鼠标收集的总DRGs不应超过30分钟。
转移DRGs到一个1.5毫升的Eppendorf管用蓝色吸头尖端切断。快速向下旋转DRG并从DMEM中吸出。加入1ml含有125U/ml XI型胶原酶的DMEM，并使用保持在培养箱中的旋转振荡器在37℃温育旋转90分钟。转速的最佳范围约为35-45 rpm。
吸出胶原酶的DMEM和重悬DRG与1毫升DMEM。当添加DMEM时，DRGs将浮动。等待DRGs下降，然后吸出。重复此步骤至少五次，以完全去除胶原酶。
注意：尽量不要完全吸出。重要的是要防止DRGs被吸出。
使用截止的蓝色移液器吸头转移DRGs到15毫升锥形管。然后使用蓝色尖端研磨至少15次，直到获得均匀的细胞悬浮液注意：研磨应该很温柔。避免产生气泡，尽量不要触及锥形管的底部。
在约239×g离心管3分钟以除去上清液中的细胞碎片。重悬细胞沉淀在1ml Neurobasal培养基补充B27和胰蛋白酶5至10次。然后使细胞通过安装在50ml锥形管上的70μm细胞过滤器。等待2分钟，然后使用吸管帮助过滤器倒入Neurobasal/B-27培养基，以便通过过滤器的细胞容易脱落。再等一分钟。
将板解离的细胞置于用0.01％聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白（3μg/ml）预包被的6孔板上，并非常温和地摇动板以使细胞均匀分布。每孔加入总共6×10 6个DRG神经元。然后，将板置于保持在37℃的CO 2培养箱中注意：用蒸馏水稀释聚-D-赖氨酸（0.01％）和层粘连蛋白（3μg/ml）。聚-D-赖氨酸在37℃包被平板2小时或在4℃过夜，然后用蒸馏水洗涤平板两次。然后，在室温下用层粘连蛋白包被平板2小时，并用PBS洗涤两次。然后在室温下干燥板，然后进行细胞接种。
共培养需要在解离的DRG神经元的初始铺板后4小时建立。原代腹膜巨噬细胞由成年C57BL6小鼠制备。在CO 2室中处死小鼠后，精细地解剖腹部皮肤以暴露腹膜。
注入10ml冰冷PBS到腹膜。轻轻按摩腹膜1-2分钟。然后，吸出PBS并转移到新的50ml锥形管。
将灌洗液在239℃下在4℃离心10分钟以沉淀细胞。将细胞沉淀物在室温（RT）下重悬于3ml的红细胞裂解缓冲液中3分钟，然后在4℃下以239×g离心10分钟以再次沉淀细胞。
将沉淀的细胞重悬浮于巨噬细胞培养基中。将腹膜巨噬细胞接种在放置在6孔板上的细胞培养插管上，其中在4小时前已经接种了解离的DRG神经元。铺板的巨噬细胞的数目保持为培养的DRG神经元的数目的5倍
巨噬细胞铺板后4小时，用二丁酰基-cAMP（db-cAMP;100μM）或PBS作为对照处理神经元 - 巨噬细胞共培养物。在一些孔中，巨噬细胞去活化剂米诺环素与db-cAMP以10μg/ml的浓度加入。
24小时后，用新鲜巨噬细胞培养基替换培养基。共培养物保持72小时而不更换培养基
然后收集条件培养基，在239×g离心5分钟，并通过0.2μm过滤器以除去任何残留的细胞碎片。将收集的条件培养基保存在-70℃直至使用。
对于神经突生长测定，使用步骤1-3中所述的相同方法获得成体DRG神经元并解离。
将细胞沉淀重悬于补充有B27的Neurobasal-A中，将总共1×10 4个细胞（每孔）接种在用0.01％聚-D-赖氨酸预包被的8孔培养载玻片上和3μg/ml层粘连蛋白。使用与步骤6中所述相同的方法进行预涂。
将神经元培养物在培养箱中保持2小时，使细胞附着于底部。并且用在步骤15中收集的解冻的条件培养基替换培养基
在初始铺板15小时后，用4％冷的多聚甲醛直接固定细胞20分钟。
载玻片上的固定细胞用1x PBS洗涤三次，并用由10％NGS和0.1％Triton-X组成的封闭溶液孵育30分钟。然后，用1x PBS洗涤两次，用10％NGS以1：1,000稀释在室温下4小时或在4℃过夜进行一抗（Tuj-1）染色。
用1×PBS洗涤两次，并且在室温下用10％NGS以1：500稀释进行2小时的第二抗体（山羊抗兔）染色。然后，用1x PBS洗涤载玻片两次，并用安装凝胶将盖玻片安装在载玻片上
使用共焦显微镜对免疫染色的βIII微管蛋白进行图像以显现神经突生长。

数据分析

测量每个神经元的平均神经突长度以比较由不同条件培养基诱导的神经突向外生长的程度。神经节长度使用用于图像分析软件套件NIH ImageJ的Neuron J插件测量（可从 http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html ），这有助于细长结构的跟踪和量化。每个实验条件在每个培养物的两个孔中复制。将每个孔分成四个象限，在每个象限的中心获得200×放大倍数的图像（每个孔中有四个图像）。对每个图像中的所有神经元跟踪神经突，并且手动计数每个图像的DRG神经元的数量。观察到每个图像大约20个神经元，因此，对于每个孔测量约80个神经元。通过将总神经突长度除以神经元总数来计算每个孔中每个神经元的平均神经突长度。
从用PBS处理的神经元 - 巨噬细胞共培养物收集的条件培养基不支持神经突生长（图1A）。当DRG神经元与用二丁酰基cAMP处理的条件培养基一起生长时，它们不变显示出稳定的神经突生长（图1B）。如果二甲胺四环素，一种巨噬细胞去活化因子与cAMP一起被添加到神经元 - 巨噬细胞共培养物中，神经突生长活性几乎完全被消除，表明神经突生长活性需要巨噬细胞的激活（图1C）。在我们以前的研究中，我们显示从cAMP处理的神经元或单独的巨噬细胞培养物收集的条件培养基不支持神经突生长（Kwon等人，2013）。因此，神经元和巨噬细胞之间的相互作用对于神经突生长活性是至关重要的

图1.神经元 - 巨噬细胞相互作用促进神经突生长活性。用PBS（A），cAMP（B）和cAMP +米诺环素（C）处理神经元（成年DRG神经元）和腹膜巨噬细胞共培养物，。比例尺=100μm。

笔记

在使用这个协议的神经突生长测定中，DRG神经元在培养物的15小时内不生长任何显着的神经突。然而，如果允许DRG神经元生长超过15小时，即使在控制条件下也可以观察到一定程度的轴突生长。在先前研究中使用大鼠DRG神经元的神经突生长测定中报道了类似的发现（Cafferty等人，2004）。在试验实验中，我们测试几个不同的文化持续时间，我们发现15 h的文化导致控制条件最小的神经突生长，而用cAMP治疗的条件培养基实现了高度稳定的神经突生长。
为了建立神经元 - 巨噬细胞共培养物，可以将离解的巨噬细胞直接添加到没有细胞培养插入物的培养的DRG神经元中。在我们以前的研究中，我们直接比较了从直接共培养物收集的条件培养基和来自与通过细胞培养插入物分开的两种细胞类型的共培养物之间的神经突向外生长的程度（Kwon et al。，2013），两种条件之间没有差异。这表明两种细胞类型使用可溶性分子彼此连通。在我们的实验室中的以下研究发现，在这种共培养模型中，神经元分泌的CCL2负责将巨噬细胞活化为促再生表型（Kwon等人，2015）。

食谱

神经元培养基
神经基础培养基（500ml） 2％B27
1％glutamax
1％青霉素 - 链霉素
巨噬细胞培养基
DMEM
10％FBS
1％青霉素 - 链霉素

致谢

该协议由大韩民国科学，ICT和未来规划部的赠款NRF-2015R1A2A1A01003410支持。

参考文献

Cafferty，WB，Gardiner，NJ，Das，P.，Qiu，J.，McMahon，SBand Thompson，SW（2004）。调节损伤诱导的脊髓轴突再生在白细胞介素-6敲除小鼠中失败。 J Neurosci 24 ）：4432-4443。
权利要求1所述的方法包括以下步骤：（a）提取一个或多个特征向量，其中h = "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24048840"target ="_ blank">巨噬细胞通过调节损伤对背根神经节感觉神经元的再生能力的贡献。 Neurosci 33（38）：15095-15108。
（a）和（b）所示，我们的研究结果表明，这些研究结果表明，在预处理损伤后，插入文件"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26631474"target ="_ blank"> CCL2培养基神经元 - 巨噬细胞相互作用以驱动促再造巨噬细胞激活。 > J Neurosci 35（48）：15934-15947。