材料和试剂

C57BL/6小鼠（Charles River Laboratories，菌株代码：027）
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
叔戊醇（Sigma-Aldrich，目录号：240486）
70％乙醇（Decon Labs，目录号：V1401）
1ml滑动注射器（不使用Luer-Lok ^TM尖端注射器）（BD，目录号：309659）
10ml注射器（BD，Luer-Lok ^TM，目录号：309604）
25G×5/8英寸针（BD，目录号：305122）
20 G×1.16英寸血管导管（BD，Angiocath ^TM，目录号：381134）
外科缝线3-0（Henry Schein，目录号：100-7842）
70μm细胞过滤器（Corning，目录号：431751）
40μm细胞过滤器（Corning，目录号：352340）
20μm的尼龙网（Spectrum，目录号：146510）
Kimwipes（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：06-666A）
5ml聚丙烯管（Corning，Falcon ，目录号：352063）
15ml管（Corning，目录号：430052）
50ml锥形管（Corning，目录号：430290）
非TC处理的10cm培养皿（Corning，目录号：430591）
D-PBS（不含Ca 2+和Mg 2+ 2+，不含苯酚）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
0.5M EDTA，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15575020）}
Dispase II（中性蛋白酶，II级）（Sigma-Aldrich，目录号：4942078001）
低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9419）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965-092）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
1 M HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630080）
ACK裂解缓冲液（Lonza，目录号：10-548E）
生物素化的抗小鼠CD45，克隆30-F11,0.5mg/ml（Affymetrix，eBioscience，目录号：13-0451-85）
生物素化的抗小鼠CD16/32，克隆2.4G2,0.5mg/ml（BD，Pharmingen ，目录号：553143）
生物素化的抗小鼠CD31，克隆MEC13.3,0.5mg/ml（Biolegend，目录号：102504）
生物素化的抗小鼠TER119，克隆TER119,0.5mg/ml（Affymetrix，eBioscience，目录号：13-5921-85）
生物素化的抗小鼠整合素β4，克隆346-11A，0.5mg/ml（Biolegend，目录号：12603）
抗小鼠EpCAM-APC，克隆G8.8,0.2mg/ml（Affymetrix，eBioscience，目录号：17-5791-82）
链霉抗生物素蛋白T 1磁珠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：65601）的微珠中加入
链霉抗生物素-PE，0.5mg/ml（BD，Pharmingen，目录号：554061）
兔抗前SP-C，多克隆血清（EMD Millipore，目录号：AB3786）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：D5025）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：26140）
DAPI（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：D1306）
Avertin溶液（100％原液工作溶液）（参见配方）
Avertin溶液（2.5％储存工作溶液）（参见配方）
Dispase解决方案（参见配方）
1％低熔点琼脂糖（见配方）
完成DMEM（参见配方）
DNase I解决方案（参见配方）
排序缓冲区（请参阅配方）

设备

细尖小剪刀（Roboz外科器械公司，目录号：RS-5910）
精细镊子（Roboz外科器械公司，目录号：RS-5211）
水平平台轨道摇臂（VWR，目录号：40000-300）
管旋转器（Thermo Fisher Scientific，目录号：400110Q）
轨道式摇床（VWR，目录号：10027-214）
生物安全柜（VWR，目录号：89413-126）
Stratalinker（Stratagene，型号：1800）
DynaMag ^TM -2磁性分离器（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
FACS Aria细胞分选仪（BD，型号：BD FACSARIA III）

软件

FACS Diva（BD Biosciences）
FlowJo（TreeStar）

程序

注意：小鼠应根据国家和机构政策进行照顾和使用。所有方案必须经机构动物委员会批准。在我们的例子中，所有程序都由加利福尼亚州旧金山大学的机构动物护理和使用委员会批准。

鼠标解剖
1. 牺牲小鼠使用批准的吸入或可注射麻醉过量程序。我们通过腹腔注射处死小鼠。注射1ml的2.5％avertin /小鼠注意：为了本协议的目的，CO 2窒息和颈椎脱臼是不相容的。与麻醉剂过量不同，CO 2窒息使心脏停止跳动，然后在方案中稍后降低灌注质量。颈椎脱臼会破坏颈部区域的结构，这是本协议要求的完整。
2. 将鼠标按下到解剖托盘。借助于在前切牙周围的缝线环（图1A），固定头部（图1B）。用70％乙醇喷洒腹侧表面注意：固定头部有助于气管插管和以后分配输注步骤。
3. 切开毛皮，然后沿中线切开腹膜。沿着中线切开肋骨架（图1C），除了容纳大血管的顶部。
  注意：注意避免切割大血管，肺或心脏。以下步骤的成功取决于上述结构的完整性。
4. 用钳子抓住肋骨架，将膜片从其连接到肋骨的位置剪断（图1D）。然后在中线的两侧切开以去除胸骨，暴露心脏和肺（图1E）。
  
  图1.鼠标解剖步骤。固定鼠标的头部（A-B），并解剖肋骨和隔膜以暴露肺和心脏（C-E）。
心脏灌注
注意：已为用户提供了心脏灌注视频（视频1）。
1. 切下下腔静脉（IVC）和肾脏附近的主动脉放血小鼠。
  注意：快速进行灌注，因为一旦鼠标开始出血，凝块开始形成，这大大降低了灌注的质量。
2. 取连接到25 G x 5/8英寸针头的D-PBS填充的10ml注射器，并将针插入右心室（图2A），瞄准肺动脉的方向（图2B）。轻轻推动注射器的柱塞，用5ml D-PBS灌注肺部注意：
3. 在灌注结束时，切开心脏（图2C）。
  
  图2.通过右心室的心脏灌注肺。切断IVC，将针插入右心室（A），指向肺动脉方向（B）。用5ml DPBS（去除心脏）（C）灌注后的肺。
  
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  视频1.通过右心室的小鼠肺灌注的心脏
  
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气管插管
1. 翻转解剖板，使鼠标的头部更接近你。
  注意：这使气管插管，分散输液和下游操作更容易。
2. 用细镊子抓住唾液腺的两个瓣，轻轻地将它们拉开（图3A和3B）。
  注意：气管位于唾液腺下方。
3. 通过用细尖的小剪刀剪掉覆盖它的组织暴露气管。
4. 在细镊子的帮助下，用手术缝合气管，形成松结（图3C）。
5. 用细尖的剪刀，在气管的腹侧表面做一个小刻痕。
  注意：切口应该足够大，以通过20 G血管导管的鞘，这可以作为气管插管（图3D）。
6. 将20 G血管导管的护套滑入气管，并通过收紧其周围的缝线固定到位（图3E）。
  注意：不要将插管沿气管向下滑动太远，以避免插管在气管分叉进入两个主要的肺外支气管的点处使气道破裂，或者插入进入其中一支气管的插管防止以后所有的肺叶注入分泌。
  
  图3.气管插管。嘲笑唾液腺（A-B），暴露气管。用缝合线环绕气管（C），插入套管并固定到位（D-E）
分散酶和琼脂糖输注
1. 填充一个滑头1毫升注射器的最大容量分散（见配方）。
2. 将注射器连接到气管套管，并缓慢注射在注射器中的全部体积的分散酶。离开注射器到位约45秒，以允许分散在整个肺部分布，而不允许其溢出（图4A）。
  注意：你应该看到所有的肺叶膨胀。如果不是这种情况，请参阅上面的气管插管下的尖端。
3. 在另一个1ml的滑动注射器中加入0.6ml微温（即，42-45℃）1％低熔点琼脂糖（参见Recipes）。
4. 用分散液取出注射器，并迅速将含琼脂糖的注射器连接到导管注意：应尽快更换注射器，以尽量减少回流和分流的泄漏。有一个滑头，而不是一个鲁尔洛克尖注射器大大有助于在这一步的速度。
5. 将琼脂糖轻轻注入肺中，将注射器留在原位，用碎冰覆盖肺部2分钟以使琼脂糖固化（图4B）。
  原理：琼脂糖将酶进一步推入肺泡空间，有效地堵塞气道，并防止俱乐部细胞消化气道，并最终污染ATII上皮制剂。
6. 松开缝线结，将注射器和套管滑出。
  
  图4.注射分散酶，随后是琼脂糖。注射分散到肺中，随后是琼脂糖溶液（A），并用冰（B）覆盖肺以固化琼脂糖。
分散酶消化
1. 小心地从胸腔解剖出肺，用镊子抓住气管，然后在肺后面轻轻地拉出肺。避免切口肺。
2. 在培养皿中用D-PBS冲洗肺，直到没有更多的血液污染肺的外表面（图5A）。用Kim擦拭巾擦掉多余的D-PBS。
3. 切除单个肺叶，同时排除肺外气道和其他组织（图5B）。将叶片放入含有0.5ml分散酶的50 ml锥形管中（图5C）注意：不要切口或切除肺叶。为了选择性和有效释放ATII细胞，需要保持叶片完整。切断将导致污染细胞类型从气道中释放。
4. 在室温（RT）下在摇床上以150rpm孵育45分钟注意：
单细胞制备物的制备
1. 将消化的肺从50ml圆锥体吸入10cm培养皿（图6A）。加入7毫升完全DMEM和10微升DNase（见配方）。
  注意：如果没有DNase，细胞会非常粘并结块在一起，最终会降低细胞产量。
2. 使用锋利的镊子轻轻地从大气道远离肺实质。避免在大型航空公司附近挑逗（图6B和6C）。
  
  图6.粗制肺单细胞悬浮液的制备 45分钟消化（A）后，用细镊子（B-D）轻轻挑取肺实质，释放更多的细胞悬浮。
3. 将培养皿在水平平面中以60rpm摇动10分钟，以允许更多的细胞释放注意：摇摆有助于消化，但摇摆的确切速度并不重要。
4. 使用两个细镊子保持消化的肺组织在一个紧凑的质量，并重复移动一对镊子沿组织块释放更多的细胞（图6D）。
5. 丢弃气道，并通过70μm，40μm和20μm*过滤器连续应用肺粗制单细胞制剂。
  注意：
6. 计数单元格。在此步骤中，细胞产量为每只小鼠肺约25-35百万个细胞
7. 旋转细胞以300×g /分钟，10分钟，4℃ 可选：如果沉淀显示存在RBC，轻轻地将沉淀重悬在5μlDNA酶和2ml ACK裂解缓冲液中。放在冰上2分钟。使用完全DMEM将体积补足至10ml，并以300×g，10分钟，4℃下降。
8. 重悬细胞沉淀在5μlDNA酶和500μl完全DMEM
ATII细胞的磁性富集
1. 用生物素化的针对谱系（Lin）标记的抗体染色 - 向悬浮在500μl完全DMEM和5μlDNA酶：抗CD45，抗CD16 /抗体的单细胞（来自一个肺）中加入5μl的以下生物素化抗体， 32，抗CD31，抗Ter119，抗整联蛋白β4 上述抗体混合物将标记造血细胞（CD45阳性），肺泡巨噬细胞（CD45阳性和CD16/32阳性），内皮细胞（CD31阳性），红细胞（Ter119阳性），淋巴细胞（整联蛋白β4阳性））和远端肺祖细胞（整合素β4阳性）。
  注意：当从初始小鼠肺分离ATII细胞时，上述抗体量是最佳的。当用炎症细胞浸润数量增加从发炎的肺分离ATII细胞时，可以在该磁耗竭步骤中增加针对谱系标志物的抗体的量。用户应根据他们的鼠标模型和需要进行优化。
2. 在冰上孵育45-60分钟，通过轻轻轻拂细胞，间歇混合
3. 当细胞与抗体孵育时，制备使用的磁珠（2.5μlSA MyOne T1珠/1×10 6个细胞）。用1ml D-PBS洗涤珠两次以除去叠氮化物。在DynaMag-2磁选机中收集磁珠。
4. 在抗体孵育结束时，在10ml完全DMEM（在300×g，10分钟，4℃下旋转）中洗涤细胞一次，并重悬于500μl完全DMEM和5μlDNA酶中。转移细胞到1.5毫升管与适当数量的洗涤珠。在冷室中在管式旋转器上孵育30分钟，以防珠子沉降到底部
5. 磁分离 - 将带有珠结合细胞的1.5ml管置于磁分选器中2分钟。谱系阳性细胞将粘附到管壁。轻轻吸出未附着的细胞，并放入一个新鲜的1.5毫升管。将新鲜试管放在磁性和重复磁性消耗总共3次。
单元格排序
1. 转移磁性富集的ATII细胞到5ml FACS管
2. 使用生物素化的抗体与以前一样重新染色谱系标记的细胞。
3. 如前所述用完全DMEM洗涤细胞，并重悬于500μl完全DMEM和5μlDNA酶中
4. 加入1微升链霉亲和素PE（以放置所有谱系标记阳性细胞在PE通道）和5微升的EpCAM-APC（染色所有上皮细胞）。在冰上在黑暗中孵育45-60分钟，通过轻轻轻拂细胞而间歇混合。
5. 用10ml分选缓冲液（参见Recipes）洗涤细胞一次，并以5×10 6个细胞/ml重悬在具有DAPI（0.5μg/ml）的分选缓冲液中用于FACS分选。应变细胞通过一个40微米过滤器，以避免任何细胞块，可能会阻塞细胞分选机
6. 设置使用100μm喷嘴进行分选的FACS Aria细胞分选仪。使用单色控制设置补偿。
  注意：请注意，详细讨论这些方面超出了本协议的范围。新用户可能得到流式细胞术核心操作员的帮助，以根据用户可用的分拣机获得细胞分选的详细说明。
7. 排序FSC ^hi SSC ^hi，singlet，DAPI ^- live，Lin ^- EpCAM ⁺细胞（图8）（其为ATII细胞）转移到含有5ml冰冷的完全DMEM的15ml管中。通常，该方案从幼稚的小鼠每肺产生2-3×10 6个高纯度（98-99％）和高活力（97-98％）ATII细胞。
  
  图8.分离高纯度鼠ATI1细胞的FACS分选策略。显示了在磁性富集之前和之后收集的肺细胞的代表性流式细胞计数图。在y轴上显示Lin标记（CD45，CD16/32，CD31，Ter119和整联蛋白β4）的染色，而x轴显示EpCAM染色。在图上显示的事件是DAPI阴性单细胞。如上所示，围绕Lin ^- EpCAM ⁺单元格的栅极用于对单元格进行排序。

数据分析

在细胞分选结束时，通过FACS Aria重新分选分选的细胞以检查纯度。我们常规地观察到分选的细胞是98-99％Lin ^- EpCAM ⁺和97-98％活的（图8）。
可选：纯度也可以通过pro-SP-C的表达来评估，SP-C是ATII细胞的特异性标记。可以将约30,000个分选的细胞进行细胞离心，然后对前-SP-C染色以检查纯度（图9）。或者，可使用标准细胞内流式细胞术方法保存约200,000-500,000个细胞用于原-SP-C的细胞内染色。先前的方法允许可视化的细胞形态 - 前SP-C染色发现在细胞质中，并且在外观上是颗粒状的（图9，插图）。后一种方法产生更高的ATII制备纯度的定量。我们常规发现我们的分选细胞为98-99％pro-SP-C ⁺。有关详细信息，请参阅原始出版物（Sinha等人。，2016）。

图9.分选的ATII细胞的纯度。将FACS分选后来自（A）粗制肺消化物和（B）ATII细胞的细胞旋转到载玻片上，并对前SP-C，特异性ATII标记，以评估纯度
分离的ATII细胞可用于不同的目的。对于RT-PCR分析，可以将分选的细胞沉淀并随后在裂解缓冲液中裂解以用于RNA分离（根据您选择的RNA分离方法）。对于通过Western印迹的蛋白质表达分析，用10ml D-PBS洗涤细胞一次以除去血清蛋白 - 该洗涤步骤对于避免血清蛋白干扰蛋白质印迹是至关重要的。旋转细胞和重悬浮在补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒（根据您选择的蛋白质提取方法）的裂解缓冲液。或者，可以将细胞沉淀快速冷冻并储存在液氮中，直到RNA或蛋白质提取步骤。对于离体培养，这些细胞可以在基质胶或纤连蛋白包被的表面上生长或以其它方式生长，这取决于实验问题。

笔记

如果需要培养分离的细胞，所有步骤必须在生物安全柜中进行，并且应遵循通常的无菌程序。解剖仪器必须高压灭菌。
建议一个不熟悉技术实践的新用户在尝试完整的协议隔离之前获得每个步骤的一些技术经验。这将增加成功隔离的机会。
协议相当长。根据待处死的小鼠数目和所需的ATII细胞产量，完整程序可能需要7-8小时。

食谱

100％avertin储备液
10g 2,2,2-三溴乙醇 10ml叔戊醇通过加热和搅拌溶解
解决方案是光敏感;保持覆盖箔并存储在4°C
2.5％avertin工作溶液
通过在DPBS或等渗盐水中稀释100％储备液1:40制备2.5％的avertin工作溶液。
例如，1ml 100％avertin原液加上39ml DPBS。用0.22μm过滤器过滤工作溶液
解决方案是光敏感;保持覆盖箔并存储在4°C
注意：标签容器的稀释日期应在该日期后30天内使用。
分散溶液
在D-PBS中为50U/ml 一次重新制成一个1克的小瓶
将等分试样储存在-20°C
注意：避免多次冻融循环;在使用前在冰上解冻。
低熔点琼脂糖（1％）
50毫克在5毫升水中
使用沸水浴，煮沸琼脂糖至澄清
准备使用时温和触摸（约42-45°C）
准备新鲜的
完全DMEM（含有10％FBS，Pen-Strep，10mM HEPES的DMEM）
500 ml DMEM
50ml热灭活的胎牛血清 5ml Pen-Strep（10,000U/ml） 5ml 1 H HEPES
在无菌条件下在生物安全柜中进行准备;储存在4°C;保持无菌
DNase I溶液
5,000 Kunitz U/ml在D-PBS中
将等分试样储存在-20°C
注意：避免多次冻融循环;在使用前在冰上解冻。
分选缓冲液（含有2％FBS，1mM EDTA的D-PBS）
500ml D-PBS（不含Ca 2+和Mg 2+））。 10ml热灭活的胎牛血清 1ml 0.5M EDTA
在无菌条件下在生物安全柜中进行准备;储存在4°C;保持无菌

致谢

这项工作得到美国国立卫生研究院（AI65495和AI68150至C.A.L.）的支持。感谢Pooja Mehta和James Mueller对图片和视频的帮助。此协议改编自Sinha等人。（2016年）。

参考文献

Sinha，M.和Lowell，CA（2016）。在高度纯化的小鼠肺上皮细胞中的免疫防御蛋白表达。 Am J Respir Cell Mol Biol 54（6）：802-813。