材料和试剂

2 ml Eppendorf管
15ml离心管
50ml离心管
14 ml管
Fisherbrand 细胞滤网（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：22-363-548）
预分离过滤器（30μm）（Miltenyi Biotec，目录号：130-041-407）
1ml胰岛素注射器（Terumo Medical，目录号：SS + 01H1）
2.5 ml注射器
25G针（Terumo，目录号：AN * 2516R1）
未处理的96孔板（Coring，Falcon ，圆底，目录号：351177）
未处理的6孔板（Sigma-Aldrich，目录号：M8562-100EA）
未处理的培养皿，145×20mm（Greiner Bio One，目录号：639161）
小鼠：从Charles River Laboratories（CDTA）获得C57BL/6和C57BL/6重组激活基因1-缺陷型OT-I TCR（Vα2，Vβ5），Orleans，France）
B3Z T细胞系（Kb限制性，OVA特异性CD8 + T细胞杂交瘤）（Kurts等人，1996）
低内毒素OVA（50mg/ml母液）（Worthington Biochemical，目录号：LS003062）
OVA肽257-264（SIINFEKL）（多肽，目录号：SC1302）
Polybead聚苯乙烯3.0微米微球（Polysciences，目录号：17134）
Polybead染色的蓝色1.0微米微球（Polysciences，目录号：15712）
PBS（1x，pH 7.4）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010-023）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
戊二醛（25％）（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
Iscove's改良的Dulbecco培养基（IMDM）（Sigma-Aldrich，目录号：I3390-500ML）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
RPMI与GlutaMAX ^TM（Thermo Fisher Scientific，目录号：61870-010）
GlutaMAX ^{TM补充（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050061）}
β-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21985-023）
MEM非必需氨基酸溶液（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11140050）
丙酮酸钠（100mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup> TM，目录号：11360070）
CPRG（Roche Diagnostics，目录号：10884308001）
可固定活力染料eFluor 780（稀释1/10,000）（Affymetrix，eBioscience，目录号：65-0865-14）
低内毒素胎牛血清（FBS，在56℃热灭活20分钟）（Biowest，目录号：S1860）
低内毒素BSA（级分V）（Euromedex，目录号：UA1315）
CFSE（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：C34554）
Liberase TM（Roche Diagnostics，目录号：05401119001）
DNase I（Roche Diagnostic，目录号：04536282001）
红细胞裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：R7757）
EasySep ^TM鼠标Pan-DC富集试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19763）
EasySep ^TM Mouse Naive CD8 ⁺ T细胞分离试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19858）
FACS抗体（所有抗小鼠）：
1. CD69-eFluor 450（克隆H1.2F3，稀释度1/300）（Affymetrix，eBioscience，目录号：48-0691-82）
2. CD8a-PerCP-Cy5.5（克隆53-6.7，稀释1/300）（Affymetrix，eBioscience，目录号：45-0081-82）
3. TCRvβ5.1-PE（克隆MR9-4，稀释度1/500）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553190）
4. CD25-FITC（克隆7D4，稀释1/200）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553072）
5. CD4-PE-Cy7（克隆RM4-5，稀释1/300）（BD，Pharmingen ，目录号：552775）
6. CD25-APC（克隆PC61.5，稀释度1/300）（Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0251-81）
7. CD19 eFluor 450（克隆1D3，稀释1/500）（Affymetrix，eBioscience，目录号：48-0193）
8. CD3克隆（克隆17A2，稀释1/500）（Affymetrix，eBioscience，目录号：48-0032-80）
9. CD11c-FITC（克隆HL3，稀释1/500）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553801）
10. CD11c-APC（克隆N418，稀释1/400）（Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0114）
11. CD8-PE（克隆53-6.7，稀释1/500）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553032）
12. CD11b-PE（克隆M1/70，稀释度1/300）（Affymetrix，eBioscience，目录号：12-0112）
13. CD40-PE（克隆3/23，稀释度1/150）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553791）
14. CD86-PE（克隆GL1，稀释度1/300）（Affymetrix，eBioscience，目录号：12-0862）
15. MHC II类I-Ab-PE（克隆AF6-120.1，稀释1/300）（Affymetrix，eBioscience，目录号：12-5320）
BMDC培养基（见配方）
B3Z和T细胞培养（见配方）
脾消化介质（见配方）
MACS缓冲区（参见配方）

设备

培养箱（37℃和5％CO 2）
用于2ml，15ml和50ml大小的管以及96孔板的冷冻离心机
Stuart试管旋转轮耐受4°C（Bibby Scientific，型号：SB3）
多色流式细胞仪（MAQSquant，Miltenyi; FACSverse，Becton Dickinson或类似物）
多色FACS分选机（例如，BD，型号：FACSAria III）
荧光读板仪（OD：590nm）

软件

FlowJo 10软件（FlowJo，LLC。）
Prism 6软件（GraphPad Software，Inc。）

程序

第一部分。在体外BMDC中珠结合的OVA的交叉呈递分析

珠子的制备（天：-1，无菌环境）
交叉呈递实验前一天，将颗粒偶联到OVA（珠粒结合的OVA：bbOVA）。直径为3μm的聚苯乙烯珠粒用范围从100％OVA（最浓）至100％BSA（背景）的可溶性OVA和可溶性BSA包被。因为BSA不是交叉呈递的，所以用100％BSA包被的珠的制备是检查没有任何抗原涂层的珠是否能够诱导任何额外的DC活化的精确对照。

估计在第0天在交叉呈递实验期间使用的3μm珠的量。考虑至少准备至少四种不同条件：

100％OVA和0％BSA：10mg/ml OVA
50％OVA和50％BSA：5mg/ml OVA + 5mg/ml BSA
25％OVA和75％BSA：2.5mg/ml OVA + 7.5mg/ml BSA
0％OVA和100％BSA：10mg/ml BSA

根据读数差异稀释珠子。对于B3Z T细胞杂交瘤，将珠稀释1/10（其对应于约200的珠/细胞比），而对于OT-I T细胞，稀释为1/25（其对应于珠/细胞比率600 ）。
将珠子加入到BMDC中，终体积为100μl。为了分析10个样品中的交叉呈现，使用此协议的3种不同的读数，您将需要每个条件：
10个样本用于B3Z span> 1ml培养基 →100μl珠子（1/10稀释）
OT-I CD69表达的10个样品40μl珠子（1/25稀释）
因此，10个样品需要200-250μl的最终珠体积
每2毫升Eppendorf管最多250微升珠，并用1.5毫升PBS洗涤。在4℃下以19,000×g离心3分钟。重复清洗两次。
注意：如果你用3个读数评估10个样品，并做4个不同的bbOVA条件（100％，50％，25％和0％），你应该在这一点有4个管，珠子（每种条件1个）。
弃去上清液，并将珠子悬浮在如下所示的不同蛋白质悬浮液中（250μl珠子/750μl可溶性蛋白质混合物）：
OVA原液浓度：50mg/ml（工作浓度：10mg/ml）
BSA原液浓度：50mg/ml（工作浓度：10mg/ml）
条件。 1）100％OVA：0％BSA→150μlOVA sub-stock +600μlPBS
条件。 2）50％OVA：50％BSA→75μlOVA sub-stock +75μlBSA sub-stock +600μlPBS
条件。 3）25％OVA：75％BSA→37.5μlOVA原液+112.5μlBSA缓冲液+600μlPBS
条件。 4）0％OVA：100％BSA→150μlBSA缓冲液+600μlPBS
在4℃下在旋转轮上永久搅拌孵育过夜。

洗涤珠子（日：0，无菌环境）

在4℃下用19,000×g的bbOVA旋转5分钟。随后，用移液管丢弃上清液，试图不接触珠子
通过吸移重悬在1ml冷PBS中的bbOVA。在4℃下以19,000xg离心5分钟。
重复洗涤步骤两次。
将bbOVA重悬于原始体积（本例中为200-250μl）。珠子准备使用。保持bbOVA在冰上。

用bbOVA装载BMDC，与T细胞共培养（日：0，无菌环境）
96孔圆底板中的板：对于B3Z读出为100,000个BMDC /孔，对于OT-I读出为10,000个BMDC /孔（图1）。

图1.装载有BMDCs的平均96孔板的方案。在50μl用于B3Z读出的BMDC培养基中铺板100,000 BMDCs /孔，或在50μlBMDC培养基中以10,000细胞/孔用于OT-I读数。添加抗原到正确的浓度在50微升的BMDC培养基，最终体积为100微升。在该方案中，还分析了sOVA和SIINFEKL肽（参见注释2和3）。在该方案中，显示了最小设置：分析两个不同的BMDC样品，其被重复铺板。建议使用其他重复，以增加获得的数据的鲁棒性

将正确量的BMDC接种在每孔50μlBMDC培养基中
如前所述，BMDC培养基中bbOVA的最终稀释：B3Z为1/10，OT-I为1/25。请考虑在BMDC培养基中的50微升bbOVA将添加到50微升的BMDC中，每孔最终体积为100微升。因此，bbOVA浓度必须是最终稀释度的两倍（B3Z为1/5，OT-I为1/12.5）。
对于OT-I T细胞增殖读出，将BMDC与bbOVA在37℃温育1小时。因此，交叉呈递BMDC与60,000-100,000个CFSE染色的OT-I T细胞共培养，72小时后分析T细胞增殖（在步骤5a中继续）。
对于B3Z和OT-I CD69表达读数，将BMDC与bbOVA在37℃孵育4-5小时。
用100μl/孔的 0.1％ PBS-BSA（总是将试剂和溶液保持在冰上）并在4℃下以800×g离心2分钟。轻拂板，重复洗涤两次。
固定交叉呈递BMDC：添加50μl/孔新鲜制备的0.008％（体积/体积）的PBS-戊二醛（GTA），并在冰上孵育5分钟。通过移液混合细胞和PBS-GTA
向PBS-GTA 0.008％溶液中加入50μl的PBS-甘氨酸0.4M，并在4℃下以800×g离心2分钟。轻推板。
加入100μlPBS-甘氨酸0.2M，并在4℃下以800×g离心2分钟。轻推板。
用200μl/孔的B3Z和T细胞培养基洗涤两次（见Recipes）。再次离心并轻弹板。
重悬在100微升/孔的细胞培养基中固定，交叉呈递BMDC
在100μl细胞培养基（至终体积200μl）中每孔加入60,000-100,000个效应细胞（B3Z或OT-I，参见注释4和5）。
在37℃下对于B3Z T细胞孵育16小时或在37℃下对OT-I T细胞孵育18-20小时。

分析OT-I细胞的B3Z读出和CD69表达（天：1）

B3Z测量：

在4℃下以800×g离心2分钟。可以保留上清液用于随后的细胞因子分析
用100μl/孔的
在4℃下以800×g离心2分钟。可以保留上清液用于随后的细胞因子分析
用100μl/孔的 0.1％ PBS-BSA，离心并轻弹板
将细胞在4℃下用70μl/孔的在 1％ PBS -BSA（稀释因子在材料和试剂中提供）。离心并轻弹板。
用 0.1％ ; PBS-BSA，离心并轻弹板
重悬于100μl/孔的
图2.交叉表示分析的门控策略。通过测量细胞表面的CD69表达来激活OT-I T细胞。 BMDC与固定并与OT-I T细胞共培养的bbOVA（上图）和sOVA（参见注释2）（下图）孵育5小时。 16小时后，测量CD69表达。 b。 OT-I T细胞的增殖。 BMDC在bbOVA（上图）和sOVA（下图）存在下孵育1小时，并与CFSE标记的OT-I T细胞共培养72小时。通过用流式细胞术测量CFSE染色的损失和通过计算增殖指数来解决增殖（右图）。

OT-I T细胞增殖分析（天：3）

在4℃下以800×g离心2分钟。可以保留上清液用于随后的细胞因子分析
用100μl/孔的 0.1％ PBS-BSA，离心并轻弹板
染色细胞在4℃下40分钟，用70微升/孔的CD8a-PerCP-Cy5.5，TCR v6.1-PE，CD25-APC和CD4-PE-Cy7的组合以 1％ PBS-BSA因素在材料和试剂中提供）。离心并轻弹板。
用 0.1％ ; PBS-BSA，离心并轻弹板
重悬于100μl/孔的
第二部分。 bbOVA由脾CD8 ⁺树突状细胞的交叉呈递，离体分析

在该方案中，用OVA包被的蓝色染色珠被静脉内注射到小鼠中。随后，在DC已经内化颗粒抗原并在体内交叉呈递之后，收获脾并消化。然后纯化来自完整消化的脾的CD11c +细胞，并将富集的CD11c +级分染色。将具有吞噬珠粒的CD8 + sup/+ DC分选并与OT-I T细胞共培养用于进一步分析（图3）。

图3.抗原交叉表现方法在体内的工作流程
1. 珠的制备（天：-1）
2. 洗涤珠子（天：0）
3. 注射小鼠，纯化DC并与T细胞共培养（Day：0）（参见图3）
数据分析

每个单个实验需要以足够数量的技术重复（至少一式三份）进行。结论可以从适当数量的生物学重复的分析中得出。这里显示的结果通过最少3次独立实验确认。使用FlowJo 10软件（FlowJo，LLC。）进行流式细胞术数据的分析。使用Prism 6软件（GraphPad Software，Inc。）进行统计分析。

笔记

第一部分。在体外BMDC中珠结合的OVA的交叉呈递分析
1. BMDC通过在含有GM-CSF的培养基（参见Recipes）中培养10天而产生。在使用的培养物中，CD11c和CD11b的百分比总是高于85％
2. 可以并行测量可溶性OVA（sOVA）的交叉呈递。在我们的实验室中，我们通常使用2mg/ml至0mg/ml的sOVA（4种不同的浓度通常就足够了）。
3. 据我们所知，交叉呈递的最佳对照是OVA肽257-264（SIINFEKL）。将该肽掺入细胞中并加载到MHC I类分子上而不进行处理。我们强烈建议在所有交叉表达试验中使用不同稀释度的这种对照（范围从3 ng/ml到0.001 ng/ml就足够了）。
4. 培养B3Z T细胞：在B3Z和T细胞培养基（参见Recipes）中培养B3Z T细胞，每2-3天分裂细胞;通过平稳地撞击烧瓶手动分离细胞。在交叉呈递实验前一天，以0.1×10 6个细胞/ml的浓度接种它们。与交叉呈递BMDC共培养他们。 16小时后，使用CPRG作为反应的底物，通过590nm的光密度检测β-半乳糖苷酶活性来测量T细胞活化。
5. 为了获得用于与BMDC共培养的OT-I T细胞，我们使用用于小鼠幼稚CD8 + T细胞纯化的试剂盒（从Stemcell或Miltenyi获得）在OT-I T细胞的脾和淋巴结上， I小鼠。我们使用MACS缓冲液（配方4）进行洗涤
6. 为了获得CFSE标记的OT-I T细胞，重悬悬浮1×10 7个细胞/ml的CD8 + T细胞，并用10μM的CFSE增殖染料标记10在室温下在黑暗中。用10ml PBS洗涤细胞一次，并在无菌PBS中重悬至浓度为1×10 7个细胞/ml。
第二部分。通过脾CD8 +树突状细胞交叉呈递bbOVA，离体分析
1. sOVA的交叉呈递可以并行测量。考虑注射100μl浓度为20mg/ml的OVA（i.v.）。等待30分钟而不是2小时，收获脾脏净化交叉呈递DC
2. 使用CD19，CD3和DAPI的标记，可以分别从分析中排除B，T和死细胞。请注意，蓝色染色的珠子在APC和APC-Cy7通道都是可见的。在这些通道中不应使用荧光团。
3. 考虑到脾脏中吞噬CD8 + sup + DC的比例确实很低。你应该每脾脏约100,000-200,000个细胞。尽管该量足以用于OT-I T细胞共培养（分析OT-I CD69表达和CFSE OT-I增殖），但与B3Z T细胞的共培养可能需要更多的小鼠的牺牲以及许多小时的细胞分选。当你得到足够的细胞进行B3Z分析时，他们可能已经死了。因此，我们建议不要针对交叉表示的离体分析解决此读出
食谱
1. BMDC培养基
  含有10％热灭活FBS的IMDM
  100 IU/ml青霉素
  100μg/ml链霉素 2mM glutamax
  50μMβ-巯基乙醇 1×MEM非必需氨基酸
  1×丙酮酸钠
  来自J558浆细胞瘤细胞的上清液用作GM-CSF来源（Winzler等人，1997）。
2. B3Z和T细胞培养物
  含有10％热灭活的FBS的RPMI 100 IU/ml青霉素
  100μg/ml链霉素 2mM glutamax
  50μMβ-巯基乙醇 1×MEM非必需氨基酸
  1×丙酮酸钠
3. 脾消化介质
  缓冲液0.2mg/ml（在每个脾脏中再悬浮一瓶5mg Liberase在3ml RPMI-1640中，对于15个脾脏是足够的;在每个脾脏中使用0.2ml该溶液）和DNase I 0.1mg/ml在RPMI-1640体积：每脾1.5ml）
4. MACS缓冲区
  1x PBS
  2％FBS（或2％BSA） 5 mM EDTA
致谢

这项工作由法国国家研究机构通过"未来投资"计划（法国生物成像，ANR-10-INSB-04），ANR-11-LABX-0043和CelTisPhyBio Labex（N-ANR- 10-LBX-0038），IDEX PSL的一部分（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）。我们感谢欧洲研究委员会（2013-AdG No.340046 DCBIOX），La Ligue Nationale Conte le Cancer（EL2014.LNCC/SA），Fonds Wetenschappelijk Onderzoek（FWO; 1526615N）的资助，EMBO长期研究金（ALTF 883-2011）以及Fondation RechercheMédicale（SPF20101221176）和omics @ VIB计划（由Marie Curie FP7 People Cofund共同资助）的奖学金。

参考文献
1. Alloatti，A.，Kotsias，F.，Pauwels，AM，Carpier，JM，Jouve，M.，Timmerman，E.，Pace，L.，Vargas，P.，Maurin，M.，Gehrmann，U.，Joannas， L.，Vivar，OI，Lennon-Dumenil，AM，Savina，A.，Gevaert，K.，Beyaert，R.，Hoffmann，E.and Amigorena，S。（2015）。< a class ="ke-插入文件"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26682983"target ="_ blank">树突状细胞上的Toll样受体4接合抑制结肠溶酶体融合并促进抗原的交叉呈递。免疫力 43（6）：1087-1100。
2. Croizat，K.，Tamoutounour，S.，Vu Manh，TP，Fossum，E.，Luche，H.，Ardouin，L.，Guilliams，M.，Azukizawa，H.，Bogen，B.，Malissen， Henri，S.和Dalod，M。（2011）。切割边缘：XCR1的表达定义了CD8α⁺型的小鼠淋巴样组织驻留和迁移树突状细胞。 J Immunol 187（9）：4411-
3. Dorner，BG，Dorner，MB，Zhou，X.，Opitz，C.，Mora，A.，Guttler，S.，Hutloff，A.，Mages，HW，Ranke，K.，Schaefer，，Henn，V。和Kroczek，RA（2009）。趋化因子受体XCR1在交叉呈递树突细胞上的选择性表达决定了与CD8 ⁺ T细胞的合作。免疫 31（5）：823-833。
4. Joffre，OP，Segura，E.，Savina，A.和Amigorena，S。（2012）。通过树突细胞的交叉呈递。 Nat Rev Immunol 12（8）：557-569。
5. Karttunen，J.，Sanderson，S.和Shastri，N。（1992）。
6. Kurts，C.，Heath，WR，Carbone，FR，Allison，J.，Miller，JF和Kosaka，H。（1996）。自体抗原的组成型I型限制性外源性表达在体内。 em> 184（3）：923-930。
7. Winzler，C。，Rovere，P.，Rescigno，M.，Granucci，F.，Penna，G.，Adorini，L.，Zimmermann，VS，Davoust，J.and Ricciardi-Castagnoli， ; 成熟阶段的小鼠树突状细胞生长因子依赖的长期， 185（2）：317-328。