材料和试剂

Progene ^® 1.5 ml微量离心管
V-Vial螺纹样品瓶，5 ml，带PTFE内衬盖
Pyrex Brand 9800试管，20ml
注射器
玻璃试管
大理石
YMC二醇柱
脂质（高纯度）（Avanti Polar Lipids）（例如1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基 - 磷酸胆碱[POPC]; 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基 - 磷酸乙醇胺[POPE] >
感兴趣的膜扰动剂
苯（ACS级）
甲醇（HPLC级）
Milli-Q水
3- [N-吗啉代]丙磺酸（MOPS）（> 95％）
氯化钠（NaCl，高纯度级）
乙二胺四乙酸（EDTA）（99.4-100.6％）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（在使用前在105℃真空干燥至少4小时以确保其干燥）
浓硫酸（H 2 SO 4）（ACS试剂，95.0-98.0％）
过氧化物（H 2 O 2）（30％）（ACS试剂）
偏亚硫酸氢钠（Na 2 SS 2 O 5）（ACS试剂，> 97％）
钼酸铵四水合物[（NH 4）6 Mo 6 Mo 7 SO 4·4H 2·sub > O]（ACS试剂，81.0-83.0％）
抗坏血酸（99％）
乙腈（HPLC级）
乙酸铵（CH 3 CO 2 NH 4）（≥98％）
氮气

设备

装备有转子（Eppendorf，型号：f45-30-11）的微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）
UV-Vis光谱仪（Agilent Technologies，型号：Cary 6000i）
使用1100MSD质谱仪（Agilent Technologies，型号：1100MSD）的LC/MS系统（Agilent Technologies，型号：1100系列系统）
水浴

程序

通常，对于给定的扰动剂和模型膜，在脂质与扰动剂的不同比例下计划一系列实验。样品一式三份进行。制备储备溶液以进行一组测量。对于单次测量，需要300至800nmol的磷脂;脂质量在所有样品中保持恒定。

模型膜制备
1. 为了由脂质的二元混合物形成模型膜，首先将单个脂质溶解在苯/甲醇混合物中。通常，通过精确称重〜25mg脂质并通过加入适当体积的苯/甲醇（90/10，v/v）溶液以获得5mg脂质/ml来制备单个脂质储备溶液。对于更极性的物质，例如磷脂酰丝氨酸和胆固醇硫酸盐，甲醇的比例可以增加到85/15（v/v）。在V-Vial螺纹样品瓶（5ml）中制备脂质有机溶液，以限制溶剂蒸发。
2. 将具有适当体积的脂质溶液的等分试样混合以获得所需的摩尔比。脂质的绝对量取决于计划样品的数量。
3. 然后将脂质溶液在液氮中冷冻并冻干至少16小时，以确保除去所有有机溶剂。
4. 脂质粉末在含有100mM NaCl和100μMEDTA的MOPS缓冲液（50mM）中水合，并调节至pH 7.4。通常加入适当的缓冲液体积以提供5mM的MLV原液悬浮液
5. 将样品进行3个冷冻 - 解冻循环（从液氮温度至高于凝胶 - 流体相转变温度约10℃的温度）。当样品处于高温时涡旋样品以确保脂质的适当水合。
注意：可以使用其他缓冲液，但为了测定磷脂，它们必须不含磷酸盐。
示例：模型膜制备
由具有POPC/POPE摩尔比为60/40的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油磷酸胆碱（POPC）和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基 - 磷酸乙醇胺（POPE）制成的膜;足够的脂质量为10个样品。
分子量（POPC）= 760.07g/mol;分子量（POPE）= 718.01g/mol
有机溶液：5mg磷脂/ml。
将730μlPOPC有机溶液（3.65mg;4.80μmol）与460μlPOPE有机溶液（2.30mg;3.20μmol）混合。
冻干后，所得脂质粉末（5.95mg;8.00μmol）用1.6ml缓冲液水合，得到5mM的MLV储备液。
脂质提取
对于给定的膜组合物，给定的温度和给定浓度的扰动剂，确定脂质提取。所有样品，包括对照（即，没有扰动剂），具有相同的最终体积和最终脂质浓度。
1. 每个样品是MLV悬浮液的等分试样，扰动剂溶液的等分试样和缓冲液的等分试样的组合。脂质的最终浓度设定在1.5和4mM之间，并且扰动剂的浓度取决于所需的脂质/扰动剂摩尔比。总体积应在250和1500μl之间。将合适体积的MLV储备悬浮液移液到1.5ml离心管中。加入在与脂质悬浮液相同的缓冲液中制备的扰动剂溶液的等分试样，以获得所需的脂质/扰动剂比例。加入一份缓冲液以确保所有样品具有相同的体积和相同的脂质浓度（表1）。
  表1显示了用于确定洗涤剂诱导的脂质提取的效率和选择性的样品系列的组成的实例。在这种情况下，脂质储备溶液的浓度为40mM，而洗涤剂储备溶液的浓度为10mM
  表1.样品系列示例：用洗涤剂提取脂质
2. 然后将悬浮液涡旋并在给定温度下使用水浴孵育至少30分钟。
3. 孵育后，将样品在20,800×g和1℃下离心5分钟。提取的脂质定义为存在于保留在上清液中的小扰动剂/脂质组装体中的脂质，而剩余的MLV（可能具有结合的扰动剂）团粒。对照样品（无扰动剂）的离心通常显示在颗粒中存在超过95％的脂质。
  注意：可以选择另一个温度用于离心;对照样品（无扰动剂）提供了通过离心从所剩余的MLV中分离提取的脂质的效率的定量描述。
4. 使用注射器分离上清液
5. 将沉淀重悬于500μlMOPS缓冲液中用于分析
脂质分析
进行两个平行分析以确定脂质提取的程度。首先，通过Bartlett磷测定法（Bartlett，1958）测定上清液和沉淀中的磷脂含量。第二，对上清液和沉淀进行LC-MS分析
Bartlett磷测定
1. 将含有8至70nmol磷脂的脂质样品的等分试样转移到玻璃试管中。通常，使用20μl的上清液和20μl的重悬沉淀物
2. 在玻璃试管中制备含有0（空白）和3.5mM磷酸盐的标准样品，从KH sub 2 PO 4储备溶液（3.5mM，在Milli-Q水; 47.63mg，在100ml中）。通常，制备具有3.5,2.0,1.5,1.0,0.4mM KH 2 PO 4 sub的样品。
3. 将每份标准样品的20μl等分试样转移到玻璃试管中
4. 向每个管中加入120μl浓硫酸。然后涡旋样品。
5. 向每个管中加入20μlH 2 O 2 sub（30％）。然后涡旋样品。
6. 将管全部一起加热至200℃10分钟。在加热期间，大理石放置在管的顶部以防止潜在的蒸发
7. 将样品放在工作台上并使其冷却至室温
8. 向每个试管中加入1340μlMilli-Q水。然后涡旋样品。
9. 向每个试管中加入40μlNa 2 S 2 Sub 2 O 5溶液（在Milli-Q水中为526mM; 100mg在1ml中）。然后涡旋样品。
10. 将管一起加热至〜90℃，正好5分钟。
11. 将样品放在工作台上并使其冷却至室温
12. 向每个试管中加入400μl的（NH 4）6 Sub 6 Mo 7 O 24 S 4 4H 2 （16.2mM，在Milli-Q水中; 200mg，在10ml中）。然后涡旋样品。
13. 向每个管中加入40μl抗坏血酸（568mM，在Milli-Q水中; 100mg，在1ml中，该溶液是光敏的，并且在其使用前必须保持在黑暗中）。然后涡旋样品。
14. 将管一起加热至〜90℃，恰好10分钟。将出现蓝色。
15. 将样品放在工作台上并使其冷却至室温
16. 在1小时内读取820nm处的吸光度，并用于磷脂测定（图1）
  
  图1. Bartlett分析的典型校准曲线
LC-MS分析
通过LC-MS分析测定上清液和沉淀的脂质组成。通常注射每个样品的32μl等分试样，并对每种条件进行三次重复。样品在保持在50℃的YMC二醇柱（4.6×150mm，5μm粒径）（Agilent Technologies）上洗脱。使用乙腈/乙酸铵水溶液（100mM）（85/15，v/v）以0.6ml/min洗脱磷脂7分钟。 ESI源用于正离子化模式。在250℃和12L/min下使用氮作为干燥气体。雾化气体也是氮气，保持在241kPa。
1. 将2μl等份的上清液和重悬浮的沉淀物在1ml H 2 O/MeOH（1/9，v/v）溶液中稀释。
2. 注射2μl等分试样用于LC/MS分析

数据分析

Bartlett测定
提取的磷脂的分数f由下式提供：
LC/MS分析
使用以下来确定每种脂质的提取程度：
提取％= As /（As + Ap）×100％
在哪里，
As和Ap分别是来自上清液和沉淀物分析的脂质峰面积。提取的脂质特异性通过比较每种脂质计算的提取％来获得。在不存在特异性的情况下，不同脂质的提取％应该相同。一种脂质相对于另一种脂质的提取％因子定义为其特定的提取
实施例：表2显示了洗涤剂诱导的磷脂酰胆碱（PC）/磷脂酰乙醇胺（PE）膜的脂质选择性的结果的实例。

表2.样品系列的实施例：通过洗涤剂提取脂质的选择性脂质浓度恒定（1.5mM），洗涤剂浓度变化。

笔记

对于Bartlett测定，独立三次重复的重现性通常为8％，优于10％。
对于LC/MS分析，3次进样之间的重现性通常优于1％，对于独立的三次进样，其优于5％。
对于0.75和4mM之间的洗涤剂浓度，萃取是PC特异性的，因为相对于PE萃取更多的PC。当MLV完整或完全破坏时，不能表达脂质提取特异性
LC/MS和Bartlett测定法之间的总磷脂提取的一致性反映了测定的准确性。

致谢

这项工作得到加拿大自然科学和工程研究理事会以及魁北克自然和技术通过其战略集群计划的支持。该方案改编自以前的工作（Therrien等人，2013; 2016）。

参考文献

Bartlett，GR（1958）。 Phosphorous assay in column chromatography。 J Biol Chem 234：466-468。

Bechinger，B。（2014）。 SMART模型：软膜在抗微生物肽的存在下适应和反应，也瞬时。

Schaefer，EJ，Anthanont，P.和Asztalos，BF（2014）。高密度脂蛋白代谢，组成，功能和缺乏 Curr Opin Lipidol 25：194-199。 />

Strömstedt，AA，Ringstad，L.，Schmidtchen，A.和Malmsten，M。（2010）。两亲性肽和磷脂膜之间的相互作用。 Curr Opin Colloids Interface Sci 15：467-478。

Therrien，A.，Fournier，A.和Lafleur，M.（2016）。蜂毒素的阳离子C末端片段对膜破裂的作用。物理化学B 120（17）：3993-4002。

Therrien，A.，Manjunath，P.和Lafleur，M。（2013）。用精子BSP1的牛粘合剂进行脂质提取的化学和物理要求。生物化学生物物理学（Biochim Biophys Acta）1828（2）：543-551。