材料和试剂

培养皿（35×10mm）（SARSTEDT，目录号：82.1135.500）
3M微孔手术带1.25cm（3M，目录号：1530-0）
野生型拟南芥（Col-0）种子
次氯酸钠溶液（White King Premium Bleach，Woolworths，目录号：10006062A）
无菌蒸馏水
Murashige和Skoog盐（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S8501）
Oxoid TM细菌琼脂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：LP0011）
1μM的3kDa荧光素缀合的葡聚糖溶液（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：D3305）

设备

无菌层流罩
具有滤光器组（BP 450-490 FT 510 BP 515-565，Carl Zeiss，目录号：487910）的Zeiss Axiophot光学显微镜（D-7082）
具有N.A.为0.4（Carl Zeiss，目录号：421350-9970-000 [当前版本]; 440845-0000-000 [旧版本]）的20x LD Achroplan透镜
Olympus显微镜数字照相机（OLYMPUS，型号：DP71）
植物生长室，设置在22°C，在16小时：8小时周期
P10,0.5-10μl移液管（Eppendorf，目录号：4920000024）

软件

ImageJ（位于 http：//imagej.nih.gov.ij ）

ImageJ宏和查找表（ http：//www.bio-protocol.org/attached/file/20161017/20161017210148_3943.rar ）

0WillRainbow.lut
Add-Points-From-TPSlist-To-ROImanager_.ijm
BranchInfo-to-ROI-lines-overlay_.ijm
Formatted-Points-List-To-ROImanager_.ijm
TPS-rel-expansion-prepare_.ijm
TPS-rel-expansion-format_.ijm

ImageJ插件

Stack Focuser（可在 http：//imagej.nih .gov/ij/plugins/stack-focuser.html ）

tpsDig2（可在 http://life.bio.sunysb.edu/morph/）
PAST（可在 http://folk.uio.no/ohammer/past/）
纯文本编辑器（例如，Windows上的记事本++，Mac OSX上的TextEdit或Linux上的gedit）

程序

生长和成像拟南芥幼苗
1. 在35mm直径的培养皿上在体外发芽野生型拟南芥 Col-0种子
2. 在发芽后1天，检查来自三个种子之一的子叶已经展开，并且在无菌层流罩中，使用移液管将约0.5μl的1μM3kDa荧光素缀合的葡聚糖轻轻地放置在近轴子叶表面上。等待5分钟使葡聚糖干燥。
3. 图像表皮路面细胞在蔡司Axiophot显微镜上，并收集一系列图像在不同的焦平面转换成2D细胞投影。
4. 在初始成像后24和48小时重复步骤A2-A3
从单元格大纲中提取坐标
1. 使用诸如ImageJ或Adobe Photoshop之类的程序，通过使用黑色铅笔工具跟踪细胞的背侧壁来在一个时间点创建细胞的轮廓。确保包括邻近单元格（分支）的一小块墙壁区域。将此黑色轮廓复制到具有白色背景的新TIFF图像上（图1A）。
2. 在ImageJ中打开单元格轮廓图像，确保它在黑色背景上显示为白色轮廓，刻度设置在图像上，以便进行校准。使用Skeletonize命令对轮廓进行骨架化，以产生单元格的一个像素宽的轮廓（图1B）。
3. 使用命令"分析骨骼2D/3D"执行骨架分析，选择"修剪结束"和"显示详细信息"来计算壁结之间的单独的背斜壁长度（图1B-1D）。保存"分支信息"表，将已剪枝的图像反转以在白色背景上获得黑色轮廓（图1C），并将此图像另存为TIFF。
  
  图1.单个 Arabid 表皮路面细胞的细胞轮廓。 A.细胞的背斜壁的跟踪。 B.细胞的镂空轮廓具有从细胞延伸的分支，代表相邻细胞（黑色箭头）中的壁的位点和细胞的防侧壁遇见的连接（白色箭头）。 C.通过骨架分析对细胞进行分析后，去除枝条（修剪，黑色箭头），沿着背斜壁的长度计算为壁连接处（白色箭头）之间的分枝长度。 D.（C）中两个白色箭头之间的单元格中的单个墙。
4. 使用单元格的骨架轮廓运行宏"BranchInfo-to-ROI-lines-overlay_.ijm"。它将提示图像的高度（以像素和μm为单位），并要求打开"分支信息"表。此宏将在单元格轮廓上放置带标签的重叠线，以便每个墙可以与分行信息表中的行号匹配。
5. 对在连续时间点捕获的细胞的每个图像重复步骤B1-B4。
6. 在与镂空轮廓图像相同的文件夹中，创建一个文件扩展名为".tps"的纯文本文件，每个图像包含以下两行，其中X是单元格最初成像的特定时间点。
  LM = 0
  IMAGE = imageNameTimeX.tif
7. 打开tpsDig2程序中的'.tps'文件，使用'outline对象工具'勾勒出单元格，然后右键单击该图像以获得更多选项，并选择'另存为XY坐标'。对每个时间点重复，然后保存单元格轮廓坐标的结果数据。
8. 在纯文本编辑器中打开此'.tps'数据，并使用'.txt'文件格式将X和Y坐标列表保存为每个时间点的单独文件。
9. 在ImageJ中打开单元格轮廓图像，然后运行宏'Add-Points-From-TPSlist-To-ROIManager_.ijm'。这将提示打开在步骤B8中做出的X和Y坐标'.txt'文件。然后创建适合ImageJ并且被校准到图像尺寸的格式的X和Y坐标的结果表。将结果表保存为".txt"文件，并对每个时间点重复。
10. 修改文本编辑器中每个时间点的'.txt'文件，以便第一个X和Y坐标指所有时间点上相同的相应单元格墙结点。请参阅步骤B9中在图像叠加层上生成的点的ROI数。
11. 在ImageJ中打开单元格轮廓图像，然后运行宏"Formatted-Points-List-To-ROImanager_.ijm"。这将提示打开在步骤B10中做出的新的配对的X和Y坐标'.txt'文件，并将X和Y坐标转换为适合于ImageJ的格式，该格式被校准为图像尺寸。将ROI管理器中的坐标列表另存为'.zip'文件。
12. 对每个时间点重复步骤B9-B11。
生成薄板花键
1. 在ImageJ中使用单元格轮廓图像和ROI'.zip'文件记录每个时间点对应于每个墙交叉点的ROI数。
2. 为了进行薄板样条分析，在每个时间点需要相等数量的同源地标。通过将初始时间的壁长度除以0.5μm来计算在所有时间点上的背斜壁段的同源界标的数目如下：
  d = w /0.5μm
  在哪里，
  d是舍入到最接近的整数的背斜墙段中所需的轨迹数（同源地标）。
  w是每个壁段的长度。
3. 使用斜率截距公式计算这些同源地标的位置：f（a）= m×a +（p - [m×d]）
  m =（p-1）/（d-1）
  在哪里，
  f（a）是从描述每一天的单元格轮廓的xy坐标对列表中选择的轨迹，
  p是在墙的一部分中的xy坐标对的数目，
  m是斜率的梯度
4. 可编辑的示例Excel文件可用于组织数据并获得输出坐标的最终列表，如步骤C2和C3中所述（请参阅数据分析）。它包含一个包含6个标签的电子表格;称为intervalRaw的输入标签，具有称为intervalSelection的每个时间点的输出x和y坐标的标签以及标记为t1，t2，t3和t4的四个数据标签，其包含在每个时间点的x和y坐标对的完整列表，与在步骤B10中生成的文件相同的布局。可以通过复制其他行的公式来修改输入选项卡以适合不同数量的墙。可以添加附加时间段，其中为时间点t4提供的布局的示例为时间点t4留空。对于输出选项卡，梯度（m）和常数（b）的单元格引用需要与所选的墙和时间段匹配。这可以在列B到E的公式中通过将每个壁的最后轨迹（红色突出显示的行）之后的行增加1的两个单元格引用的值来实现。可能需要根据每个墙中的轨迹数修改输出标签中列B到E中的公式。
5. 所选坐标应按如下方式排列成标签列，并在文本编辑器中作为每个时间段的".txt"文件保存：
  no，x，yIJ，yTPS
  1，823，286，853
  2，824，287，852
  3 ... ... ...
6. 通过在ImageJ中打开单元格轮廓图像，检查所有坐标已正确选择为等间距，运行宏格式化点 - 从 - TPSlist-To-ROIManager_.ijm'并打开同时创建的'.txt'文件点。这将在ROI管理器中将'.txt'文件中的所有点显示为图像上的叠加层
  
  图2.在Notepad ++文本编辑器程序中打开的.tps文件，显示了在三个时间段具有四个同源地标的示例数据集。此示例数据集显示如何将.tps文件排列为以同源地标（LM）的数目，随后是那些坐标的x和y值，图像名称（IMAGE）和时间段（ID）的数目。附加时间段的数据以直接下面的相同顺序输入。
7. 使用文本编辑器将每个时间点的数据合并为一个新的'.tps'文件，每个时间段使用以下行（图2）：
  LM =同源地标数量
  x ₁ = x坐标1 y <1> = y坐标1（以TPS格式）
  x ₂ = x coordinate 2 y <2> = y坐标2（以TPS格式）
  ... ...
  IMAGE = imageNameTimeX.tif
  ID =时间段数
8. 使用所有时间点的'.tps'文件为时间n + 1和n + 2，n + 2和n + 3，等创建新的tps文件。
9. 在PAST中打开'.tps'文件，选择所有数据单元格，然后使用选项执行Procrustes转换，使用2D，旋转到主轴并保持大小（仅平移和旋转）。对于时间n对n + 1，时间n + 1对n + 2，等等执行薄板样条和"薄板样条和翘曲2D"并保存薄板样条的位图（BMP）图像。这些应保存为两种不同的格式;通过选择展开因子和取消选择颜色映射来输出（1）灰度格式的图像，以及（2）取消选择展开因子的平滑薄板样条格式。
生成显示相对膨胀率
的薄板样条图像
1. 使用在步骤C9中生成的灰度薄板样条图像上的折叠生长尺度记录在薄板样条图像上呈现为覆盖图的每个时间间隔的最大和最小折叠膨胀值（图3A）。
2. 使用公式ln（最大折叠展开）/时间n + 1和n之间的小时数确定最大相对膨胀率。这应该是所有天的最大相对扩展。因为这将设置在相对扩展标度上表示的最大扩展值，可以将其调整为数据集所需的最接近的循环数。
3. 在ImageJ中的每个时间间隔打开灰度薄板样条图像。使用点工具在每个网格正方形的中心放置一个点，并将每个ROI添加到ROI管理器。将每个时间点的ROI点列表保存为单独的".zip"文件。
4. 运行宏"TPS-rel-expansion-prepare_.ijm"。该宏将要求由PAST产生的灰度薄板样条图像和在上一步骤中产生的相应ROI".zip"文件。这将自动提取每个点的灰度值和XY坐标，然后将此信息保存为"xyGrayscaleValues-NAME.txt"。对每个时间点重复此操作。
5. 运行宏'TPS-rel-expansion-format_.ijm'。它将提示"xyGrayscaleValues-NAME.txt"文本文件，用于着色的空白薄板样条图像和在步骤D3中做出的ROI'.zip'文件。此外，需要在对话框中输入以下值：（1）所有时间段的最大扩展（倍增长），（2）所有时间段的最小扩展（倍增长），以及（3）最大对数比扩展（这将是最终比例将是什么，所以如果你有多个单元格，请确保这个值足够大，以覆盖所有的用例，请参阅步骤D2）。这将生成附加有标签'-output'的薄板样条的相对膨胀率的彩色PNG图像（图3B）。对每个时间点重复。
  
  图3.从时间n到时间n + 1的单个拟南芥表皮铺面细胞的生长的薄板样条。 A.由PAST制成的薄板样条是一个灰度倍增生长测量。 B.在处理提取灰度值并重新整理网格之后，可以确定细胞的薄板样条随时间的相对膨胀率。

数据分析

薄板样条分析用于可视化对象的大小和形状的变化。通过比较细胞的薄板样条，可以看出由较暖的颜色和生长方向所指示的相对生长速率较高的区域通过网格形状的变化来表示。该协议使用细胞的轮廓随时间推移对细胞壁的不同区域的生长进行近似。这允许识别生长速率的不同区域，而不是生成适于进一步统计分析的绝对膨胀值具有代表性数据的电子表格显示了如何对步骤C2-C4中概述的数据进行排序，这些数据在文件Intervals-calculation.xls（ https://en-cdn.bio-protocol.org/attached/file/20161017/20161017210209_7507.xls ）

笔记

这种方法被设计用于可视化单细胞生长的变化，但它可以适应不同的空间尺度。生长条件，例如所用营养物的浓度或种类，或光强度可能在实验之间变化。改变使用的细菌琼脂的百分比可以影响幼苗的根生长。琼脂需要足够软，以使根穿透它，但是坚固到足以牢固地嵌入根并且可以为幼苗的生长提供牢固的锚。宏运行时间将取决于图像和数据的大小。对于诸如图3B中的单个单元，宏在15秒时在Intel Core i5处理器上的运行时间通常为2-15秒，最慢的宏是TPS-rel-expansion_format.ijm。薄板样条的每个单独网格的展开率和RGB值的原始值的附加文本文件被自动保存在与步骤D5（ExpansionValues-NAME.txt和xyColourValuesNAME.txt）的输出图像相同的文件夹中，。

致谢

该协议改编自Armor等人2015年。该研究得到了澳大利亚WJA研究生奖的支持。

参考文献

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