材料和试剂

6厘米板
1.5ml管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
人结肠癌细胞系HCT116（ATCC）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup> TM）
丙酮
双蒸H 2 O（ddH 2 O）
2x SDS上样缓冲液（含有200mmol/L DTT）
Tris-HCl（pH = 8.0）
氯化钾（KCl）
氯化镁（MgCl 2）
二硫苏糖醇（DTT）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
硫酸
三氯乙酸酯（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6399）
三氯乙酸（TCA）溶液（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

Pipettor（Eppendorf）
离心（冷却和室温）（Eppendorf）
旋转器
分光光度计（Bio-Rad Laboratories）
金属浴

程序

整个过程的概述如图1所示。

图1.在协议
中描述的完整过程的方案

使用任何常用的方法在1ml冰冷的PBS和沉淀（1000×g，5分钟，4℃）中收集HCT116细胞（6cm平板，70-90％汇合）。< br/>
弃去上清液，加入1ml冰冷的PBS，轻轻吸取以重悬细胞，然后再次沉淀（1,000×g，5分钟，4℃）。
弃去上清液，将细胞沉淀重悬在400μl裂解缓冲液中，并在4℃下旋转孵育30分钟。
通过在冷却的离心机（12,000×g，10分钟，4℃）中旋转来制粒完整的核。
将含有组蛋白的上清液转移到新鲜的1.5ml管中
逐滴加入133微升TCA到组蛋白溶液中，倒置管数次以混合溶液（TCA的最终浓度为25％）。（最好添加一滴并立即倒转管以混合溶液，然后再添加一滴）。溶液随时间出现乳白色。
在冰上孵育30分钟或过夜。
通过在冷却的离心机（12,000×g，10分钟，4℃）中旋转来沉淀组织蛋白。
小心除去上清液和用1ml冰冷的丙酮洗涤组蛋白沉淀，而不打扰它。丙酮用于从溶液中除去酸而不溶解组蛋白沉淀
在离心机中以12,000×g离心，在4℃下离心10分钟
重复步骤9和10，再次洗涤组蛋白沉淀
在室温下小心地除去所有的上清液和空气干燥的组蛋白沉淀30分钟
将组蛋白沉淀溶解在适当体积的ddH 2 O（例如，100μl适合于6cm平板）中，并转移到新鲜的1.5ml管中。
用分光光度计（使用OD 280）检测组蛋白溶液的浓度，我们可以从6cm平板上的70-90％汇合孔获得1-2μg组蛋白。
加入相同体积的2x SDS加载缓冲液到组蛋白溶液中，并在金属浴（100℃，5分钟）煮沸，然后进行蛋白质印迹。

代表数据

图2.用依托泊苷处理HCT116细胞并进行组蛋白酸提取。用指定的抗体进行免疫印迹。

注意：相对的Western印迹也已经在我们的论文Oncogene（Cao等人，2016）中发表。有关详细信息，请参阅Cao等人，2016年的图4（ https://www.researchgate.net/publication/274316705_ATM-mediated_KDM2A_phosphorylation_is_required_for_the_DNA_damage_repair ）。

食谱

三氯乙酸（TCA）溶液
在227ml ddH 2 O中的500g TCA 储存在室温下，避光
裂解缓冲液
10mM Tris-HCl，pH8.0 1 mM KCl
1.5mM MgCl 2·h/v 10mM DTT（使用前立即加入）
1x蛋白酶抑制剂混合物（在使用前立即加入）
0.4 M硫酸（使用前立即加入）

致谢

这项工作得到了北京市自然科学基金资助项目7164305，国家自然科学基金（81222028,81321003,81472581,81530074,31570812和91319302）的'973项目'（2011CB910100,2011CB504200和2013CB911000）和资助项目（B70001）来自中国科学技术部。该方案改编自以前在Cancer Research（Zhu等人，2001），Oncogene（Cao等人，2016）和Oncotarget（Lu等人）中公开的工作， et al。， 2015）。

参考文献

Bannister，AJ和Kouzarides，T。（2011）。通过组蛋白修饰调节染色质。 Cell Res 21（3）：381-395。

Cao，LL，Wei，F.，Du，Y.，Song，B.，Wang，D.，Shen，C.，Lu，X.，Cao，Z.，Yang，Q.，Gao，，L.，Zhao，Y.，Wang，H.，Yang，Y. and Zhu，WG（2016）。 ATM介导的KDM2A磷酸化是DNA损伤修复所必需的。癌基因 35：301-313。

Kouzarides T.（2007）。染色质修饰及其功能。 128：693-705。

Lu，S.，Yang，Y.，Du，Y.，Cao，LL，Li，M.，Shen，C.，Hou，T.，Zhao，Y.，Wang，H.，Deng，D.，Wang ，L.，He，Q.and Zhu，WG（2015）。转录因子c-Fos与组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶2A配位以激活环氧合酶-2的表达。 Oncotarget 6（33）：34704-34717。

Strahl，BD和Allis，CD（2000）。 403（6765）：41-45。

Zhu，W.G.，Lakshmanan，R.R.，Beal，M.D.and Otterson，G.A。（2001）。 DNA甲基转移酶抑制增强由组蛋白脱乙酰酶抑制剂诱导的凋亡。 Cancer Res 61（4）：1327-1333