材料和试剂

15ml离心管（Corning，Falcon ，目录号：352099）
50ml离心管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
10cm细胞培养皿（Greiner Bio One，CellStar ，目录号：664160）。
0.2μm25mm注射器过滤器（Pall，Acrodisc ，目录号：4612）
30ml注射器（BD，Luer-Lok ^TM，目录号：302832）
5ml聚苯乙烯荧光激活细胞分选（FACS）管（Corning，Falcon ，目录号：352054）。
100μm的尼龙网孔过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352360）
6孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：140675）
来自患者的人类WATRW />
OXOID TM磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：BR0014G）}
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
胎牛血清（FBS），热灭活（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：16140071）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
抗体（见表1）
异丙醇（EMD Millipore，目录号：109634）
胶原酶IA型（Sigma-Aldrich，目录号：C9891-1G）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A0171）
注意：此产品已停产。
碳酸氢钾（KHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：P7682）
注意：此产品已停产。
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25200056）
Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F-12）（1:1）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11330032）}
青霉素 - 链霉素（P/S）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140122）
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D4902）
10mg/ml来自牛胰腺的胰岛素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：I0516）
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（Sigma-Aldrich，目录号：I5879）
吲哚美辛（Sigma-Aldrich，目录号：17378）

100％乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
表1.抗体信息

抗原		抗体	制造商	稀释	主机 /同种型
CD34	造血细胞	抗人CD34 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0349	1：100	小鼠IgG1，κ
CD31	内皮细胞	抗人CD31 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0319	1：100	小鼠IgG1，κ
CD14	（巨噬细胞）造血细胞	抗人CD14 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0149	1：100	小鼠IgG1，κ
CD11b	（白细胞）单核细胞	抗人CD11b APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0113	1：100	小鼠IgG1，κ
CD45	（造血起源的成核细胞）淋巴细胞	抗人CD45 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-9459	1：100	小鼠IgG1，κ
CD106	（活化的）内皮细胞	抗人类CD106 PE	Affymetrix，eBioscience，目录号：12-1069	1：100	小鼠IgG1，κ
CD90	MSC	抗人CD90 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0909	1：100	小鼠IgG1，κ
CD44	MSC	抗人CD44 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0441	1：100	大鼠IgG2b，κ
CD29	MSC	抗人CD29 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0299	1：100	小鼠IgG1，κ
CD73	MSC	抗人CD73 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-0739	1：100	小鼠IgG1，κ
CD105	MSC	抗人CD105 APC	Affymetrix，eBioscience，目录号：17-1057	1：100	小鼠IgG1

<多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
油红O粉末（Sigma-Aldrich，目录号：O0625）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
胶原酶溶液（1mg/ml）（参见配方）
红细胞（RBC）裂解缓冲液（10x）（参见配方）
增殖培养基（参见配方）
分化介质（参见配方）
感应介质（见配方）
胰岛素介质（参见配方）
10 mM地塞米松储备溶液（见配方）
1 mM地塞米松工作溶液（见配方）
0.5 M IBMX储备溶液（1,000x）（参见配方）
200 mM吲哚美辛储备液（1,600x）（参见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（pH = 7.4）（参见配方）
油红O工作溶液（见配方）

设备

低温小瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：366656）
层流组织培养罩
灭菌手术工具，包括镊子和手术刀或剪刀
Frosty ^TM冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：5100-0001）
Locator 6 Plus Rack and Box Systems，liquid nitrogen Dewar（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：CY50985-70）
BD FACSCanto II流式细胞仪（BD，型号：BD FACSCanto II）或类似设备
分析天平（Sartorius，型号：CPA124S）
37℃轨道摇床（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：4450）。
用摆动式转子离心机（KUBOTA，型号：2800）
自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，Countess ^®，目录号：AMQAF1000）

软件

FACSDiva软件（BD）

程序

细胞分离
1. 从患者收集0.2-1.0 g的人类WAT 注意：我们已经利用这个协议从孤立从经历胃切除术或胃旁路手术过程的病态肥胖个体的表面皮下WAT分离ASCs，如前所述（Leow et al。，2016）。然而，在我们实验室的未发表的研究中，我们还利用该方案成功地从经历腹腔镜腹股沟和腹侧疝手术的瘦患者的深部皮下，网膜和肠系膜WAT中分离出ASC。
2. 将人类WAT活检转移到预先称重的50ml PBS管中注意：最多1 g的WAT应该在一个50 ml离心管中消化。
3. 计算WAT组织重量
注意：对于以下步骤，在层流组织培养罩中工作。
1. 将组织转移到10厘米的细胞培养皿，并用灭菌的手术刀或剪刀将组织切成小块。
  注意：为了更好的组织消化，WAT应彻底切碎。
2. 将切碎的组织转移到50ml管中。加入3毫升胶原酶溶液/1克组织。对于小于0.3 g的组织，使用1毫升胶原酶溶液。
  注意：胶原酶溶液应该用预热的PBS（从37℃水浴）新鲜配制。
3. 在37℃培养箱中振荡（120 rpm）1.5小时，消化组织。
  注意：消化后不应显示WAT的大块。如果WAT的块仍然可见，则消化时间可以相应地延长。
4. 通过加入35毫升增殖培养基到50毫升管中的灭活胶原酶。
5. 立即在室温下以800×g离心10分钟
6. 离心后，细胞沉淀应在50ml管的底部可见。
7. 小心吸出上清液（包括脂肪层），并重悬细胞沉淀在RBC裂解缓冲液中。对于1ml沉淀，加入9ml RBC裂解缓冲液（1:9，v:v）。
8. 在室温下孵育10分钟。
9. 立即在室温下以800×g离心10分钟
10. 通过上下吹吸将细胞沉淀重悬在20ml增殖培养基中。
11. 通过一个100微米尼龙网格细胞过滤器过滤细胞悬浮液到一个新的50ml管，以清除碎片
12. 立即在室温下以800×g离心10分钟
13. 小心吸出上清液并将含有ASCs的细胞沉淀重悬于10ml增殖培养基中
14. 将细胞悬液转移到细胞培养处理的10cm板上，并在37℃/5％CO 2下孵育24小时。
15. 在24小时细胞培养后，除去非贴壁细胞，并用PBS洗涤贴壁细胞。将贴壁细胞（ASCs）在新鲜的增殖培养基中培养直到70％汇合
16. 通过ASCs 1-2次以扩大细胞群。生长的ASC的代表性图像显示在图1A中。在培养几天后，人类ASCs显示典型的成纤维细胞样形态（图1A）。
17. 然后可以将ASC用于相关的体外研究或冷冻保存。为了冷冻保存ASC，胰蛋白酶消化并计数0.5-1百万个细胞，并在室温下以800×g离心10分钟。吸出上清液并将细胞沉淀物重悬在1ml含有5％DMSO的低温小瓶中的预冷冻（4℃）增殖培养基中。将装有异丙醇的Frosty ^TM冷冻容器在-80℃下储存过夜，然后转移到液氮杜瓦瓶中长期储存。
  
  图1.人类ASCs和来自ASCs的成熟脂肪细胞 A.从表面皮下WAT（比例尺=100μm）分离的增殖的人ASCs培养物的代表性相差图像。 B.人类ASCs衍生的成熟脂肪细胞的代表性相差图像（比例尺=200μm）。 C.来源于ASCs的成熟脂肪细胞中油红O染色的脂滴的代表性相差图像（比例尺=200μm）。 D.在来源于ASCs的成熟脂肪细胞（比例尺=50μm）内油红O染色的脂滴的代表性高放大率相位对比图像。
细胞表面标记染色和流式细胞术
1. 胰酶消化ASC和计数细胞数。
2. 在每个5ml FACS管中收集约20万个细胞
3. 立即在4℃下以200×g离心5分钟，并抽吸上清液。
4. 用3ml PBS洗涤细胞沉淀两次。
5. 加入2毫升冰冷的4％PFA到每个细胞沉淀，并通过轻轻涡旋重新悬浮细胞沉淀。
6. 在4°C孵育30分钟或保持固定细胞在4°C进行随后的免疫荧光染色（长达6个月）。
7. 用3ml PBS洗涤固定的细胞两次。
8. 用1ml 15％FBS的PBS悬浮细胞沉淀，孵育20分钟阻断
9. 立即在200×g离心5分钟，并抽吸上清液
10. 用在PBS中的冰冷的15％FBS中稀释的50μl一级抗体重悬细胞沉淀（关于抗体信息，请参见表1）。
11. 在冰上孵育45分钟。
  
  图2.通过流式细胞术分析人ASCs的表面标志物表达谱。分析分离的人ASCs（来自浅表皮下WAT）的MSC标志物（CD90，CD44，CD29，CD73和CD105），造血谱系标记（CD34，CD14，CD11b和CD45）和内皮标记（CD31和CD106）。直方图显示来自一个代表性实验的指示表面标记物的ASC的染色结果。细胞计数在y轴上指示，荧光强度在x轴上指示。根据用合适的同种型匹配的抗体对照的染色设置门P2。每个面板中显示了阳性染色的ASC的百分比
12. 加入5ml冰冷的0.5％BSA的PBS溶液。
13. 立即在4℃下以200×g离心5分钟，并抽吸上清液。
14. 用200μl冰冷的0.5％BSA的PBS悬浮细胞沉淀
15. 使用BD FACSCanto II机器（BD）和FACSDiva软件（BD）软件分析样品，用于数据采集。
  注意：可以使用其他FACS硬件和软件包。
16. 通常，我们发现超过98％的分离的ASCs表达MSC标志物，包括CD90，CD44，CD29，CD73和CD105。然而，少于1％的分离的ASCs表达造血细胞（CD34，CD14，CD11b和CD45）和内皮细胞（CD31和CD106）的标记的细胞表面标记（图2）。
脂肪分化
1. 胰蛋白酶消化ASC和计数细胞数量
2. 平板细胞在细胞培养物处理的增殖培养基中的6孔板（参见Recipes）中以10,000细胞/cm 2的密度处理。
3. 让细胞生长至融合，并等待另外48小时阻止细胞分裂
4. 用诱导培养基（分化培养基，含有1μM地塞米松[从10mM地塞米松储备溶液稀释]，58μg/ml胰岛素，0.5mM IBMX和200μM吲哚美辛，参见Recipes）处理细胞2周（我们观察到长期和更复杂的实验研究[Leow等人，2016]，用诱导培养基的处理可以减少到1周）。用新鲜诱导培养基每3天更换培养基。用胰岛素培养基（分化培养基，含有10μg/ml胰岛素，参见Recipes）处理细胞。每2天更换培养基与新鲜胰岛素培养基。可以在用胰岛素介质治疗后第4天至第7天测定细胞。分化的ASC培养物的代表性图像显示在图1B中，填充有脂滴的成熟脂肪细胞的簇是可见的
5. 为了评估脂质积累，在分化的成熟脂肪细胞上进行油红O染色（Ramirez-Zacarias等人，1992）。对于油红O染色，除去培养基并用2ml PBS /孔洗涤细胞。用2ml的4％多聚甲醛（PFA）/孔在室温下固定细胞30分钟，然后用4ml H 2 O /孔洗涤细胞。用2ml的60％异丙醇/孔孵育细胞5分钟。吸出异丙醇，细胞与2毫升油红O工作溶液/孔在室温下孵育30分钟。吸取油红O工作溶液，并在拍摄图像之前用H 2 O洗涤细胞。油红O染色的成熟脂肪细胞的代表性图像显示在图1C（4x物镜）和1D（20x物镜）中。油红O染色的脂滴是清晰可见的

数据分析

为了表征分离的人ASCs的表面标志物表达，使用BD FACSCanto II仪器（BD）收集流式细胞术数据，每个样品获得10,000个事件。根据合适的同种型匹配的对照抗体的染色强度设定门P2。使用FACSDiva软件（BD）进行数据分析。在该方案中仅显示来自一个ASC培养物的代表性数据。然而，该方案已经用于评估几种独立ASC培养物的纯度，获得相似的结果。在该方案中没有进行统计分析。

笔记

该协议已被用于从几个WAT活检中分离人类ASCs，并且该方案被证明是可重复的。
我们已经用于研究脂肪形成分化潜能的ASCs的最高传代是第10代。然而，先前的研究已经表明，ASCs通过多次传代维持成脂分化能力（直到至少第15代）（Dicker等，，2005）。

食谱

胶原酶溶液（1mg/ml）（新鲜制备）
10mg IA型胶原酶
200mg BSA
用预热的（37℃）PBS补充至最终体积为10ml 使用0.22μm注射器过滤器过滤灭菌
红细胞（RBC）裂解缓冲液（10x）
824mg NH 4 Cl 100 mg KHCO ₃
4mg EDTA
用PBS
补充至100 ml 使用0.22μm过滤器过滤灭菌
增殖培养基
DMEM/F-12
20％FBS
1％P/S
使用0.22μm过滤器过滤灭菌
分化媒介
DMEM/F-12 10％FBS
1％P/S
使用0.22μm过滤器过滤灭菌。
感应介质（新鲜制备）
分化媒介
1μM地塞米松
58微克/毫升胰岛素
0.5 mM IBMX
200μM吲哚美辛
胰岛素培养基（新鲜制备）
分化媒介
10μg/ml胰岛素
10mM地塞米松储备溶液（2000x）
在20ml的100％乙醇中重建78.5mg地塞米松使用0.22μm注射器过滤器进行过滤灭菌并在4℃下保存
1mM地塞米松工作溶液稀释地塞米松储备溶液到1mM的地塞米松工作溶液与PBS使用前。
0.5 M IBMX储存解决方案（1,000x）
在9ml DMSO中重构1g的IBMX 使用0.22μm注射器过滤器过滤灭菌
分成1ml级分，并储存在-20℃下
200 mM吲哚美辛储备液（1,600x）
在1ml DMSO中重建71.567mg吲哚美辛
使用0.22μm注射器过滤器进行过滤灭菌，并在-20℃下保存
4％多聚甲醛（PFA）（pH = 7.4）向48ml H 2 O中加入4g多聚甲醛加热溶解
滴加2N NaOH，直到溶液变得澄清
加入50ml的2x PBS并混合
从热中取出并冷却溶液
将pH调节至7.4
分成10毫升级分，并储存在-20℃下
油红O工作溶液（新鲜制备）
将300mg油红O粉末溶解在100ml的99％异丙醇中作为油红O储备溶液（在室温下储存）
为了制备油红O工作溶液，将3份油红O储备溶液和2份H 2 O混合，并在室温下孵育10分钟
通过滤纸
过滤油红O工作溶液使用过滤的工作溶液在2小时内染色

致谢

我们要感谢Khin Thida Soe在新加坡国立大学医院（NUH）的患者招聘和协调人类WAT活检收集。这项工作得到新加坡临床科学研究所，科学技术和研究机构（A * STAR）核心资助。我们还承认以前从Baglioni等人发表的协议。（2009），Baglioni等人。（2012）和van Harmelen等人。（2005），基于此修改了当前协议。

参考文献

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Baglioni，S.，Francalanci，M.，Squecco，R.，Lombardi，A.，Cantini，G.，Angeli，R.，Gelmini，S.，Guasti，D.，Benvenuti，S.，Annunziato， Bani，D.，Liotta，F.，Francini，F.，Perigli，G.，Serio，M.和Luconi，M.（2009）。分离自内脏和皮下脂肪组织的人成体干细胞群的表征。 FASEB J 23（10）：3494-3505。

Dicker，A.，Le Blanc，K.，Astrom，G.，van Harmelen，V.，Gotherstrom，C.，Blomqvist，L.，Arner，P.and Ryden，M。（2005） ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15925364"target ="_ blank">来自成人脂肪组织的间充质干细胞的功能研究。 Exp Cell Res 308（2）：283-290。

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Ramirez-Zacarias，JL，Castro-Munozledo，F.和Kuri-Harcuch，W。（1992）。通过用油红O染色胞质内脂质来定量脂肪转化和甘油三酯。组织化学 97（6）：493-497。 >

van Harmelen，V.，Skurk，T。和Hauner，H。（2005）。人类脂肪细胞前体细胞的原代培养和分化。 Methods Mol Med 107：125-135。