材料和试剂

1.5 ml Eppendof管
12ml塑料培养管（Greiner Bio One，目录号：184261）
石英比色皿
根系和/或芽（7日龄幼苗）
拟南芥拟南芥
硝酸钾（KNO 3）（国药化学试剂，目录号：10017218）
去离子水
MS媒体
液氮
水杨酸（国药化学试剂，目录号：30163517）
硫酸（98％）（国药化学试剂，目录号：100216008）
氢氧化钠（NaOH）（国药化学试剂，目录号：10019718）
500mg / L（0.0357mol / L）KNO 3标准溶液（参见食谱）
5％（w / v）水杨酸 - 硫酸（参见食谱）
8％（w / v）NaOH溶液（参见食谱）

设备

50ml烧瓶
冷冻混合球磨机（RETCH，型号：MM400）
可见光分光光度计（PGENERAL，目录号：T6）
离心机（Eppendorf，型号：5424）

软件

高强

程序

标准曲线
1. 为了制成标准曲线，加入1ml，2ml，3ml，4ml，6ml，8ml，10ml和12ml的NO 3标准溶液（ 500mg / L）分别转移到八个50ml烧瓶中，并将去离子水加入每个溶液中以使总体积达到50ml。一系列标准溶液的浓度分别为10,20,30,40,60,80,100和120 mg / L。 10,20,30,40,60,80,100和120mg / L KNO 3的摩尔浓度为0.0007,0.0014,0.0021,0.0029,0.0043,0.0057,0.0071,0.0086摩尔/升， L。
2. 将0.1ml各标准溶液分别转移到12ml管中。使用0.1ml去离子水作为对照。
3. 向每个管中加入0.4ml水杨酸 - 硫酸并充分混合，然后在室温下温育所有反应20分钟。
4. 向每个管中加入9.5毫升8％（w / v）NaOH溶液，冷却管（由反应产生的热量）至室温（约20-30分钟），并测量OD 410 / sub>值与控制参考。
5. 绘制硝酸盐浓度为水平轴的标准曲线，吸光度为垂直轴。然后，可以根据标准曲线获得回归方程（图1）。具体方法如下：
  1. 打开一个Excel，输入A列中的OD <410>数值和列B中标准溶液的硝酸盐浓度。选择所有包含值的单元格，然后插入散点图。
  2. 选择图中的任意数据点，右键单击，选择添加趋势线，选择线性和显示方程，然后获得标准曲线和回归方程。
  图1.标准曲线。使用10,20,30,40,60,80,100和120mg / L标准溶液建立标准曲线。误差条代表生物重复的SD（n = 4）。根据标准曲线，回归方程为C（μg/ ml）= 140.86×OD 410 < - 1.1831，其中C代表硝酸盐浓度。
拟南芥中的硝酸盐测定
1. 将幼苗在半MS培养基上生长7天（如图2所示），并分别收集幼苗，芽和根以测定硝酸盐含量。
  
  图2.拟南芥幼苗的水培栽培系统 A.阿拉伯种子种子种植在纱布网上已经通过高压灭菌消毒的250微米的筛孔尺寸）。 B.纱布网放在支架上。确保烧杯中的中等水平达到纱布网。
2. 将每个称重的样品（≤0.1g，例如，在半MS上生长的约20-25个7天龄的野生型幼苗）通过液氮在1.5ml管中冷冻，并将每个样品研磨成粉末，频率为30 /秒使用RETCH MM400 1分钟。
3. 在管中加入1ml去离子水，并在100℃下煮沸20分钟（至少）。
4. 将样品以15,871×g离心10分钟，并将0.1ml上清液转移到新的12-ml管中。使用0.1ml去离子水作为对照。
5. 向每个管中加入0.4ml水杨酸 - 硫酸，将样品充分混合，然后在室温下孵育反应20分钟。
6. 向每个管中加入9.5毫升8％（w / v）NaOH溶液，并将管冷却至室温（约20-30分钟）。用参考的控件测量每个样品的OD值410 值。
7. 根据上述步骤中得到的OD 410值，用回归方程式计算硝酸盐浓度（℃）C（μg/ ml）= 140.86×OD 410 <在步骤A（图1）中获得的1.1831。
8. 使用以下公式计算硝酸盐含量：
  Y = CV / W
  哪里，
  Y：硝酸盐含量（μg/ g），
  C：用OD 410计算的硝酸盐浓度作为步骤B7（μg/ ml）回归方程式，
  V：提取样品的总体积（ml），
  W：样品重量（g）。

数据分析

表1. WT的根的硝酸盐含量将幼苗在半MS培养基上生长7天，并收集根以测定硝酸盐。

注意：植物组织中硝酸盐含量的其他结果发表在“拟南芥NRG2蛋白介导硝酸盐信号并与之相互作用并调节关键的硝酸盐调节剂”（ http://www.plantcell.org/content/28/2/485 。长）。

笔记

收集幼苗，芽和根时，每个样品应在一分钟内收获
每个样本应至少有三个重复。
当向管中加入水杨酸 - 硫酸酸时，样品间隔时间应相同
煮沸样品时，煮沸时间至少为20分钟
用于测量样品的OD 410的比色皿是石英比色杯。

食谱

500mg / L（0.0357mol / L）KNO 3标准溶液
将0.7221g KNO 3溶于去离子水中，然后加入dH 2 O 2至200ml
储存于4°C
5％（w / v）水杨酸 - 硫酸
5克水杨酸在100ml硫酸中的溶液防止光照，储存在4°C，并在7天内使用
8％（w / v）NaOH溶液
80 g NaOH在1 L蒸馏水中存放在带有橡胶塞的玻璃瓶中

致谢

这项研究得到了国家自然科学基金资助项目（31170230）和泰山学者基金会对Y. W.的支持。该方案主要基于Cataldo等人（1975）和Vendrell等人的方法。（1990）。

参考

Bremner，JM（1965）。＆nbsp; 土壤方法分析。第2部分。在In：Black，C.A。（Ed。）。 pp：1216-1219。
Carlson，RM和Keeney，DR（1971）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https://dl.sciencesocieties.org/publications/books/abstracts/acsesspublicati/instrumentalmet/39”target =“ _blank“>特定离子电极：土壤，植物和水分析中的技术和用途。在Walsh，LM（Ed。）。土壤和植物组织分析的工具方法。土壤科学研究院 pp：39-65。
Cataldo，DA，Maroon，M.，Schrader，LE and Youngs，VL（1975）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/ 00103627509366547“target =”_ blank“>通过硝化水杨酸来快速比色测定植物组织中的硝酸盐。通用土壤科学计划 6：71-80。
Huffman，SA和Barbarick，KA（1981）。＆nbsp; 坚实通过镉还原进行硝酸盐分析。通用土壤科学分析12：79-89。
Vendrell，PF和Zupancic，J.（1990）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00103629009368334?journalCode=lcss20”target = “_blank”>通过水杨酸的硝化来测定土壤硝酸盐。通用土壤科学计划 21：1705-1713。
Xu，N.，Wang，R.，Zhao，L.，Zhang，C.，Li，Z.，Lei，Z.，Liu，F.，Guan，P.，Chu，Z.，Crawford，NM and Wang ，Y.（2016）。拟南芥NRG2蛋白介导硝酸盐信号传导并与重要的硝酸盐调节剂相互作用和调控。植物细胞28（2）：485-504。