材料和试剂

Kimble Corex管（30ml）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：0950037）
Hamilton气密注射器（Avanti Lipids Polar，目录号：610017）
聚碳酸酯膜过滤器，0.4μm（Avanti Lipids Polar，目录号：610007）
宽范围pH试纸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：14-850-1）
玻璃管
4ml半微量比色皿（SARSTEDT，目录号：67.745）
Hellma Suprasil石英比色皿（Sigma-Aldrich，目录号：Z802433）
玻璃小瓶
N ₂
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸 - （1'-外消旋 - 甘油）（POPG）（Avanti Lipids Polar，目录号：840457C ）（注1）
氯仿（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：C298）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
特氟隆衬里密封件（Avanti Lipids Polar，目录号：600460）
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）（Avanti Lipids Polar，目录号：850457C）
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）（Avanti Lipids Polar，目录号：850757C）
乙醇
氯化钾（KCl）
柠檬酸一水合物（C 6 H 8 O 7 O 7·H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C1909）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇（AMPD）（Sigma-Aldrich，目录号：A9754）
氯化铁（III）六水合物（FeCl 3·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：236489）
微孔过滤灭菌水（ddH 2 O）（EMD Millipore，目录号：Milli-Q Advantage A10水纯化系统）
硫氰酸铵（NH 4 SCN）（Sigma-Aldrich，目录号：221988）
柠檬酸盐 - 磷酸盐缓冲液（参见配方）
AMPD缓冲区（请参阅配方）
硫氰酸铵溶液（参见配方）

设备

氮气罐
通风橱
真空干燥器（Eppendorf，型号：Vacufuge Plus）
纳米粒度分析仪（Malvern Instruments，型号：Zetasizer Nano S90）（Zetasizer Nano Series Technical Note，Malvern Instruments： https://caliscc.org/images/presentations/Morante_Zeta_Potential.pdf ）
Nanosphere ^TM聚合物微球尺寸标准，尺寸为60±2.7nm（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：3060A）
巴斯德移液器
Vortexer（Bio-Rad Laboratories，型号：BR 2000）
过滤器支架（Avanti Lipids Polar，目录号：610014）
Accumet pH计（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ^TM，目录号：AB15 Plus）
Avanti Mini Extruder Kit（Avanti Lipids Polar，目录号：610023）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，型号：Ultrospec 2100 Pro）
Zeta电位分析仪（Brookhaven Instruments，型号：ZetaPlus Zeta电位分析仪）
ζ电位参考材料（Brookhaven Instruments，目录号：BI-ZR5）

软件

Zetasizer软件
Microsoft Excel

程序

脂质体制备
1. 使用气密注射器等分所需的脂质体积到Kimble Corex管中。对于说明的协议，添加200微升25毫克/毫升POPG氯仿储备管中。（注2和3）
2. 将脂质在通风橱中在温和的N 2蒸汽下干燥约30分钟（注释4）。
3. 为了除去残留的氯仿，将脂质在干燥器中在真空下进一步干燥过夜
4. 将干燥的脂质水合并通过在1ml相应的磷酸盐柠檬酸盐缓冲液（pH 2.0至8.0）或AMPD缓冲液（pH 8.0至10.0）（参见Recipes）中剧烈涡旋再悬浮并再温育30分钟（注释5） br />
5. 将水合脂质通过保持在适当温度的0.4μm膜（注6）挤出19次
质量控制和脂质体大小
1. 在Zetasizer Nano S90中通过动态光散射分析所得脂质体以确认如图3A所示制备的样品的均匀性和准确尺寸。
  1. 使用具有以下测量参数的90°散射光学器件进行尺寸测量。温度：25±1℃;分散剂：磷酸盐缓冲盐水;折射率：1.332;粘度：0.9128cP;平衡时间：1分钟;测量：自动;分析模型：通用（正常分辨率）。仪器校准使用Nanosphere ^TM尺寸标准进行
  2. 将每个样品60μl置于石英比色皿中，并以1分钟间隔连续三次测量
  3. 通过Zetasizer软件分析散射数据，如图3B和3C所示。
2. 挤出后的脂质体的pH通过使用如图3D所示的pH纸来验证
3. 囊泡样品的脂质浓度的测量使用测量磷脂 - 铵亚铁氰化物络合物的已建立的比色测定法进行（Marom和Abdussalam，2013）。
  1. 校准曲线如下产生：
    1. 在玻璃管中加入40μlPOPG（25mg/ml）到9.96ml氯仿中，制备0.1mg/ml POPG的储备溶液。
    2. 在表1所示的玻璃管中制备11个POPG样品
    3. 在加入亚硫氰酸铵和氯仿后，涡旋样品各1分钟
    4. 两个单独的阶段将变得明显。使用巴斯德吸管，小心地取出上层相并丢弃
    5. 将下层转移到合适的试管中，使用分光光度计测量488nm处的吸光度。不含POPG的样品用作空白。
    6. 488nm处的吸光度对脂质浓度（mg/ml）的曲线图用作校准曲线（图3E）。
      
      表1.用于绘制校准曲线的反应混合物
      
      图3.脂质体表征 A.通过动态光散射表示均匀群体的由100mol％POPG制备的脂质体的代表性强度分布图。 B.100mol％POPG脂质体的平均直径（Z-平均值）。 C.100mol％POPG脂质体的多分散指数。 D.在使用pH试纸验证的各种pH缓冲液中水合和挤出后脂质体的各自的pH。 E.代表性磷脂校准曲线。
  2. 脂质体样品的脂质浓度如下测量：
    1. 加入10微升准备的脂质体到玻璃管。加入2ml亚硫氰酸铵并涡旋1分钟
    2. 加入1.99ml氯仿并涡旋1分钟
    3. 将脂质体在各自的缓冲液中稀释至1mg/ml的浓度。
ζ电位测量使用ZetaPlus Zeta电位分析仪（参见参考文献10）进行
1. 加入1.6毫升1毫克/毫升脂质体样品在4毫升半微量比色皿。
2. 打开ZetaPlus软件，并在"参数"对话框中更改相应的条件。测量参数如下。电场：14.86V/cm;电流21.37 mA;电导：3936μS;粘度：0.890cP;折射率：1.330;介电常数：78.54;温度：25℃。使用的电极是ZetaPlus，SR-516型电极（注7）
3. 测量进行三次，10次循环（注8）