材料和试剂

Falcon管架（Kasvi，目录号：K30-1552）
12孔细胞培养板 - 一次性（TPP，目录号：92012）
手动移液器200μl提示（Corning，Axygen ^®，目录号：T-200-Y）
手动移液器1000μl提示（Corning，Axygen ^®，目录号：T-1000-B）
铝箔
玻璃载玻片（Kasvi，目录号：K5-7101）
盖玻片（Kasvi，目录号：K5-2450）
Falcon管，50ml（Kasvi，目录号：K19-0050）
胚胎发生悬浮培养物。 angustifolia，根据Steiner等人建立的方法诱导的。（2005）
纤维素酶（Sigma-Aldrich，目录号：22178）
硝酸钾（KNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：V000944）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：V000199）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：V001861）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：V000104）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：104873）
MnSO 4 H·H 2 O（Labsynth，目录号：S2036）
ZnSO 4 7H·7H 2 O（Labsynth，目录号：S1072）
硼酸（H 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：31146）
碘化钾（K1）（Sigma-Aldrich，目录号：V000130）
氯化钴（II）六水合物（CoCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：V000213）
CuSO 4 H 5·5H 2 O（Labsynth，目录号：S1054）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1651）
FeSO 4 7HH 2 O（Labsynth，目录号：S1057）
Na 2 EDTA（Labsynth，目录号：E2005）
肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I17508）
烟酸（Labsynth，目录号：A1043）
吡哆醇（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T4625）
L-谷氨酰胺（Labsynth，目录号：G1011）
蔗糖（Labsynth，目录号：2731）
MSG培养基（参见配方）

设备

通过高压灭菌器（121℃，30分钟）灭菌的细胞离解筛网（150目（Sigma-Aldrich，目录号：CD1-1KT））
室流（或其等效物）（Pachame，型号：PA 220）
适配的玻璃锥形瓶（定制的）（图1），通过高压灭菌器（121℃，30分钟）灭菌。对烧瓶的这种调节可以由生产实验室玻璃器皿的公司进行，将玻璃管熔合到锥形烧瓶。
标尺
轨道振动器（或其等同物）（Cientec Equipamentos paraLaboratório，型号：CT-165）
分析天平（或其等价物）（Shimadzu，型号：BL3200H）
通过高压灭菌器（121℃，30分钟）灭菌的小铲（VWR，目录号：231-2233）
AxioPlan光学显微镜（Carl Zeiss，型号：AxioPlan）
手动移液器（或等效物）（Eppendorf，目录号：3120000062和3120000054）
强制空气循环干燥炉（或其等同物）（Ethik Technology，型号：420-6D）
AxioCam MRC5数码相机（Carl Zeiss，型号：AxioCam）
桌面计算机

图1.用于SCV分析的改型Erlenmeyer烧瓶（100和50ml）。对于100ml容量的改造的Erlenmeyer烧瓶，我们使用25ml培养基和500mg新鲜细胞。对于具有50ml容量的改造的锥形瓶，我们使用10ml培养基和200mg新鲜细胞，比例为20mg新鲜细胞与1ml培养基。

软件

AxioVision Rel。 4.8软件（Carl Zeiss，AxioVision）

程序

SCV分析
1. 首先，在流动室中，使用细胞离解筛（150目筛）从培养基中分离胚胎发生悬浮培养物（图2A）。
  
  图2. SCV分析程序。 A.使用筛子从培养基中分离细胞; B.对SCV分析对细胞进行取样（以鲜重计）;适用于带有接种细胞的培养基的锥形瓶; D.将细胞和培养基转移到适应的Erlenmeyer烧瓶的侧面管中用于SCV测量; E.锥形瓶直立保持15分钟; F和G.使用标尺进行SCV测量的详细信息。
2. 然后，将200mg由分离的细胞组成的培养物（鲜重）置于含有10ml含有所需测试处理的培养基（图2B和2C）的适应的Erlenmeyer烧瓶（图1）中。
3. 为了测量初始SCV，将烧瓶的全部内容物（培养基和细胞）转移到锥形瓶外面的适应管（图2D）。在Falcon管架中保持直立（图2E）15分钟。
4. 此后，使用尺子测量初始SCV（图2F和2G）。
5. 然后，通过小心地倒转以确保将大部分细胞返回到锥形瓶中（图2C），将全部内容物（培养基+细胞）返回到锥形瓶中。保持适应的锥形瓶在水平摇床（100 rpm在黑暗中25±2℃）。
6. 为了确定PEM生长，每三天重复测量程序，直到PEM达到下降阶段。
注意：
1. 进行细胞生长曲线（图3）以鉴定悬浮的胚性培养物的细胞生长的阶段。这种鉴定可用于建立形态评估和生化研究的取样点。
2. 如果使用100ml容量的锥形瓶，我们建议以下比例：每500毫克新鲜细胞使用25毫升培养基。
  
  图3.通过SCV的细胞生长的图示。通过SCV分析从胚胎发生悬浮培养的细胞生长曲线。 angustifolia 在MSG培养基中显示孵育期间的不同阶段
新鲜和干重测量
1. 使用12孔细胞培养板进行此分析。
2. 在流动室中，使用筛子从悬浮培养物中分离细胞以仅收集细胞;丢弃培养基（图2A）
3. 接下来，使用分析天平（图2B）称重细胞并将60mg新鲜细胞置于细胞培养板的每个孔中，每孔应含有2ml培养基（图4A）。
4. 关闭细胞培养板并保持在水平振荡器上孵育（在25±2℃下在黑暗中100rpm）。
5. 为了测量特定天的鲜重（例如通过生长曲线确定），取细胞培养板并使用移液管小心地移除液体培养基（图4B）。对每个井重复此过程。
6. 使用刮刀从每个孔中收集细胞培养物的所有固体成分（图4C），单独地，在一块预先称重的铝箔上。
7. 使用分析天平测量细胞的鲜重（图4D）。在70℃下干燥样品48小时。然后，在分析天平上再次测量样品加上铝箔。必须减去铝箔的重量（预称重）以获得干重。
  
  图4.使用12孔细胞培养板测量鲜重。A：具有细胞培养物的12孔细胞培养板; B.使用移液管去除液体培养基; C.使用刮刀从每个孔收集细胞; D.使用预称重的铝箔，用分析天平测量鲜重。
的幻灯片准备
1. 首先，在流动室中，使用细胞解离筛（150目筛）从培养基中分离胚胎发生悬浮培养物（图2A）。
2. 然后，将1200mg分离的细胞，鲜重（图2B）放入含有60ml含有所需试验处理的培养基的锥形烧瓶（250ml容量）中。每个处理的三个烧瓶应保持三次生物学重复
3. 在孵育期间将培养瓶置于水平摇床上（100rpm，在25±2℃的黑暗中）
4. 为了分析在特定天的孵育结果，在流动室中，从改进的移液管尖从液体培养基中取得PEM的样品。必须移除移液管尖端的末端（图5A和5B），以防止PEM的破裂。移液器吸头在使用前必须进行灭菌。
5. 将一滴PEM培养物放在载玻片上（图5C），并用盖玻片覆盖。
6. 在光学显微镜下观察。
注意：
1. 可以将烧瓶中的剩余细胞返回到水平摇动器，以在分析的第二天使用。如果不继续孵育，细胞将被丢弃，则无需使用消毒的移液器吸头进行取样。
2. 或者，可以在具有较小体积（保持20mg新鲜细胞与1ml培养基的比例）的锥形瓶中孵育PEM。
  
  图5.从胚胎发生悬浮培养物中制备PEM的载玻片。 A.去除尖端的末端; B.切割前后刀尖的比较; C.用悬浮培养物中的一滴PEM涂覆。
分离的胚胎形成细胞和悬浮细胞的载玻片制备
1. 首先，通过将培养基中的PEM悬浮培养物与
2. 为了捕获图像进行形态分析，我们使用AxioVision Rel。 4.8软件根据以下程序（其他可比较的图像分析软件应该足够）：
  1. 打开AxioVision Rel软件。 4.8，然后在工具栏中选择：查看>工具栏>标准
  2. 要查看屏幕上的图像：单击"Live"选项。
  3. 在软件中设置您使用"捕捉"选项捕获图像的目标和目标的规格。
  4. 保存图像时，选择.zvi格式。
形态测量和分析程序
1. 面积测量
  1. 在显微镜软件中打开图像。
  2. 选择选项：查看>工具栏>测量。
  3. 要测量区域，请使用工具选项"outline"或"outline spline"。
  4. 然后，围绕胚胎头绘制闭合形状（图6A和7）。当窗体关闭时，图中的区域以μm²显示。此值用于区域分析。
  5. 重复这个操作几个胚胎头和悬吊型细胞图像样品
    
    图6.PEM和分离的细胞的测量方案 A.来自非解离的PEM的胚胎头部和悬挂器型细胞的面积分析; B.解离的胚发生和悬浮细胞的直径，长度和宽度分析
    
    图7.使用AxioVision软件的非离解PEM的面积测量程序箭头（红色）表示使用的工具选项。
2. 直径，宽度和长度测量
  1. 在显微镜软件中打开图像。
  2. 选择选项：查看>工具栏>测量
  3. 要测量面积，请使用工具选项"长度"。
  4. 然后，使用"长度"工具，测量胚胎型细胞以获得直径数据（参见图6B中的红线和图8中的黑线）。
  5. 使用"长度"工具，测量悬挂器型单元格的长度和宽度，如图8中的黑线所示。
  6. 对解离的胚胎发生细胞和悬浮细胞的几个样品重复该操作
注意：
1. 在南洋杉中，因为胚发生型细胞是等比体的，所以根据直径测量大小，并且作为悬吊型细胞是椭圆形和伸长的，使用长度和宽度测量大小（在细胞中间）（图8）。
2. 如果悬挂式单元格是弯曲的，则可以使用"曲线样条"工具，如图9所示。
  
  图8.使用AxioVision LE软件测量胚胎形成细胞和悬浮细胞型细胞的直径，宽度和长度。红色箭头表示用于胚胎形成细胞的直径分析的工具B.长度和悬挂器型细胞中的C.宽度
  
  图9.宽度和长度测量使用AxioVision软件悬挂细胞型细胞。红色箭头表示用于弯曲悬挂器型细胞长度的"曲线样条"工具，黑色箭头表示用于这些单元格宽度的"长度"工具。

数据分析

对于面积，直径，长度和宽度的分析，可以以图形格式处理和呈现不同样品的值。另外，可以通过使用适当的统计软件对数据进行方差分析（ANOVA）和平均分离测试（例如Tukey或SNK）。
SCV分析：获自SCV分析的结果的实例可以在Silveira等的图1中观察到。（2006），Osti等人的图2。（2010）和Douétts-Peres等人的图4。（2016）。
新鲜和干重分析：图5的Douétts-Peres等人。（2016）是新鲜和干重测量的一个例子
细胞尺寸测定：这里描述的胚胎头和悬吊型细胞的面积测量（图6）可以在Douétts-Peres等人的图7中观察到。（2016年）。此外，胚胎型细胞的直径和悬吊型细胞的宽度和长度可以在Douétts-Peres等人的图8中观察到。（2016）。

食谱

MSG培养基（1L）（Becwar等人，1989）

制备液体MSG培养基

为了制备1L液体MSG培养基，称取30g蔗糖并溶解在〜500ml蒸馏水中
加入100ml溶液A，5ml溶液B，10ml溶液C和2ml溶液D.加入1,460mg L-谷氨酰胺。
溶解所有试剂。用蒸馏水调节体积至1L。混合培养基并调节pH至5.7。在高压灭菌器中在121℃灭菌15分钟

储备溶液的制备

准备储备溶液A，B和D，在分析天平中称量试剂，溶于蒸馏水中，并用蒸馏水补足最终体积。
为了制备储备溶液C，称重每种试剂，并分别加入〜150ml加热的蒸馏水（〜45℃）。然后，混合两种溶液并将最终体积调节至500ml。保护此溶液免受光照。

致谢

这项工作得到FAPERJ（里约热内卢州研究支持基金会）和CNPq（国家技术和科学发展委员会）的支持。所提出的VCS方法源自Silveira等人。（2006）。

参考文献

Becwar，MR，Noland，TL和Wyckoff，JL（1989）。 L.）体细胞胚胎到植物。体外细胞发育25（6）：575- 580.

Douglas-Peres，JC，Cruz，MA，Reis，RS，Heringer，AS，de Oliveira，EA，Elbl，PM，Floh，EI，Silveira，V.and Santa-Catarina，（单极纺锤体1）蛋白质抑制作用影响细胞生长和前胚胎发生的质量（Araucariaceae）的胚胎发生培养物中的形态。 11（4）：e0153528。

Osti，RZ，Andrade，JBR，Souza，JP，Silveira，V.，Balbuena，TS，Guerra，MP，Franco，DW，Floh，EIS和Santa-Catarina，C。（2010）。< a class = ke-insertfile"href ="http://dx.doi.org/10.1016/j.plantsci.2006.02.015"target ="_ blank">亚硝酰基乙二胺四乙酸钌（II）络合物促进细胞生长，可用作一氧化氮植物科学 178（5）：448-453。

Silveira，V.，Santa-Catarina，C.，Tun，NN，Scherer，GFE，Handro，W.，Guerra，MPand Floh，EIS（2006）。多胺对内生多胺含量，一氧化氮释放，南洋杉胚胎悬浮培养物的生长和分化的影响angustifolia （Bert。）O.Ktze。 Plant Sci 171（1）：91-98。

Steiner，N.，Vieira，FDN，Maldonado，S.和Guerra，MP（2005）。