材料和试剂

玻璃试管（VWR，目录号：47729-578）
剃刀刀片
塑料存储容器和刮刀
玻璃闪烁瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：B7999-6）
玻璃巴斯德吸液管
96孔平底板（Greiner Bio One，目录号：655-101）
50ml Falcon管（VWR，目录号：89039-658）
胰蛋白胨（BD，Bacto，目录号：211705）
琼脂（BD，Bacto，目录号：214010）
葡萄糖（Alfa Aesar，目录号：A16828）
酪氨酸（Teknova，目录号：C2000）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：230391）
生物膜矿物培养基（BMM）（参见配方）

10x基础盐溶液
维生素溶液
痕量金属溶液

Luria Bertani（LB）琼脂平板（见Recipes）
聚集琼脂板（见配方）

磷酸钾缓冲液
1mM FeSO 4
20mM MgSO 4

设备

马铃薯捣碎器（见注释）
BioMate TM分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：335904P）
注意：此产品已停产。类似的模型是BioMate TM suppectium分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：840208400）。
MaxQ 4000台式摇动培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：SHKA4000）
Synergy TM sup/2 Mx 2多模式酶标仪（BioTek Instruments），具有Gen5 TM sup/2.02 PC软件（BioTek Instruments）
通风橱
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，型号：Sorvall ^TM ST 40R），具有50ml桶插入物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{>，目录号：75003674）}
水浴超声器（Thomas Scientific，Branson ，目录号：1207K40）
使用转子型（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM）离心（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，型号：Sorvall >，型号：F13-14x50 cy）
离心机（Eppendorf，型号：5424）
台式标准轨道摇床（VWR，型号：3500）
1升量筒

程序

绿脓菌素提取
1. 在LB琼脂平板上接种来自冷冻储备物的铜绿假单胞菌菌株PAO1，并在37℃下孵育24小时。
2. 移取5ml BMM到3个无菌试管中，接种生长在LB琼脂上的分离的PAO1菌落，并在37℃下以200rpm振荡孵育16小时。
3. 测量3个生物重复的OD 600（BioMate 3分光光度计），并通过用新鲜BMM稀释将细胞培养物标准化至OD 600 = 0.3。
4. 将2μl标准化培养物接种到新鲜制备的（3-4小时后倾倒）蜂群板的中心（在食谱部分描述），并在37°C孵育24小时。
  切割每个群集与琼脂，它占据一半使用剃刀刀片。使用塑料抹刀（图1）将一半的群落转移到一个小塑料容器中，加入5ml盐水（0.85％NaCl）。
  
  图1.将一半的群体与其占据的塑料容器中的琼脂转移
5. 使用马铃薯捣碎机，将琼脂捣碎成小块（图2），并将琼脂与盐水一起转移到40毫升玻璃闪烁小瓶（玻璃分离漏斗可以代替）。对其他两个重复进行重复。
  
  图2.将收集的群体和琼脂粉碎成小块以备提取
6. 用另一5ml盐水冲洗容器和捣碎器，收集所有剩余的琼脂块，并与含有捣碎的琼脂的第一部分合并。
7. 使用玻璃吸管，向含有捣碎的琼脂的玻璃小瓶中加入5ml氯仿。将玻璃小瓶固定到桌面定轨振荡器上，并在室温下以速度设置3摇动小瓶15分钟。为避免氯仿的毒性作用，所有涉及溶剂的步骤都应在通风橱中进行
8. 摇动后，垂直放置小瓶以使层分离。这将需要大约10分钟。
9. 通过使用玻璃巴斯德吸管，将底部氯仿层转移到干净的闪烁瓶。
  注意：如果存在绿脓菌，该层将变成蓝色。
10. 重复步骤A7-A10，向含有捣碎的琼脂的玻璃小瓶中再加入氯仿两次，并将每个重复的三个氯仿部分合并在一个小瓶中。
11. 加入5ml 0.2N HCl，并使用台式定轨振荡器在速度设置3下在室温下摇动小瓶15分钟。
12. 摇动后，垂直放置小瓶以使层分离。这将需要大约10分钟。
13. 通过使用玻璃巴斯德吸管，收集顶部HCl层和转移200微升到平底96孔板。
  注意：如果存在绿脓菌素，该层将被着色为红色。测量520nm处的吸光度（SynergyTM Mx Biotek平板读数器）。
14. 使用消光系数17.1（Kurachi，1958）计算以μg/ml计的绿脓素浓度。
总细胞蛋白定量
使用上述绿脓素提取方案的步骤A5中剩下的一半群落菌落
1. 转移剩余的一半的群集成一个小的塑料容器，并移取5毫升盐水进入它
2. 使用马铃薯捣碎机，将琼脂捣碎成小块，并将琼脂与盐水转移到50ml Falcon管（图2）。
3. 用5ml盐水冲洗容器和捣碎器以收集所有剩余的琼脂碎片，并转移到前面步骤中使用的Falcon管，从而合并所有碎片的捣碎的琼脂。
4. 在Branson 2800水浴超声仪（默认设置）中超声处理混合物15分钟，然后涡旋5分钟。重复此步骤两次。
5. 通过在1,000×g离心2分钟轻轻地沉淀琼脂碎片，小心地收集上清液而不打扰琼脂，并转移到干净的50ml Falcon管中。
6. 向琼脂沉淀中加入10ml盐水，重复步骤B4-B5。加入另外10ml，并重复步骤B4-B5。合并所有收集的上清液并通过Whatman 1号过滤器过滤以除去任何剩余的琼脂片。如果需要，应用真空。将过滤的上清液转移到干净的50ml离心管瓶中。
7. 在25℃下将滤液以17,000×g离心10分钟（具有转子类型F13-14x50cot的Sorvall RC 6+离心机）。收集沉淀，将其重悬在1ml 1N NaOH中，并转移到1.5ml微量离心管中。
8. 将样品在90℃加热10分钟，并在室温下在15,000×g（Eppendorf 5424离心机）离心5分钟。
9. 将上清液转移到新的微量离心管用于Bradford分析。根据蛋白质产量，样品可能需要稀释。在我们的实验中，我们用盐水稀释样品10次
10. 取20μl每个样品，并与200μl的Bradford试剂在96孔平底板中混合。测定牛血清白蛋白标准品在同一板中。测量在595nm的吸光度（Synergy TM sup/Mx Biotech读板仪）。根据BSA标准曲线计算蛋白质浓度，并使用它来归一化绿脓菌素数据。

数据分析

测定由集落的一半分泌的绿脓菌素的总量（图3B），并通过从集落的另一半提取的细胞蛋白的总量标准化（图3C和3D）。为了计算总蛋白，我们使用基于在Microsoft excel中绘制的BSA标准的校准曲线。仅使用产生大于0.95的R 2值的标准曲线。绿脓菌素的测量和标准化产生与突变体pcP :: Tn5的视觉观察很好相关，显示与PAO1群集相比显着降低的绿脓菌素产生。为了测试测量的准确性和一致性，将实验重复三次，每次三次生物学重复。生物学重复之间的标准偏差低于11％。我们观察到由于群体大小的差异没有额外的偏差。

图3.在em中的绿脓素产量的定量。铜绿色群体。 A.由 P形成的群体的照片。（ carP :: Tn5）和 in-trans 互补的突变体（ carP :: Tn5/ carP ）。聚集培养基[下面的食谱]补充有10mM CaCl 2。 B.测量的绿脓素的量。 C.使用Bradford测定法定量的蛋白质量。 D.通过总细胞蛋白标准化的量化的绿脓素

笔记

为了使精确的正常的绿脓菌数据正常化，将群集切成两半，因此一半可用于测量绿脓素，另一半用于测量细胞蛋白。我们还测试了一种替代方法：接种2个单独的平板，并使用一个完整菌落（或板）的绿脓素和其他菌落（或板）进行蛋白质定量。然而，菌落直径变化，这阻止了精确的标准化。
具有8×8mm均匀间隔开口的圆形马铃薯捣碎器用于方便地将琼脂破碎成大致均匀的碎片。
将未接种的聚集琼脂平板用作对照以验证琼脂组分不干扰绿脓菌素和蛋白质提取和定量。
优化超声处理，涡旋和提取步骤的次数和持续时间以允许最大可能地除去嵌入琼脂中的蜂群，并有效提取绿脓素。
使用50ml Falcon管来收集用于蛋白质定量的细胞，因为透明的壁使得容易观察琼脂沉淀。将后者在低速下离心短暂的时间，以仅沉淀琼脂，而不是细胞。为了将细胞沉淀用于以下裂解，将样品转移到50ml离心管中并以17,000×g离心。
过滤从步骤B6收集的上清液，除去所有的偶然收集的琼脂碎片。如果琼脂没有完全去除，它可以干扰NaOH的细胞裂解

食谱

生物膜基本培养基（BMM）（Sarkisova等人，2005）。
混合100毫升无菌的10倍基础盐溶液（食谱1a）到900毫升无菌纳米纯水。加入1ml维生素溶液（配方1b），200μl痕量金属溶液（配方1c）和20μl1M MgSO 4。

10x基础盐溶液
在1L纳米水中结合：
15g谷氨酸单钠 46克甘油 0.18g磷酸二氢钠二水合物（NaH 2 PO 4）
0.78g磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）
84.7g氯化钠（NaCl）
调节pH至7.0。高压灭菌
灭菌
维生素溶液
将1mg生物素溶解在10ml的超纯水中。在新管中等分1ml生物素储备溶液，向其中加入50mg盐酸硫胺素，并适当混合。使用纳米纯水将最终体积调节至100 ml。使用0.2μM过滤器进行过滤灭菌并在4℃下储存。
微量金属污染
稀释10毫升浓盐酸在70毫升超纯水中。添加以下成分：
0.5g CuSO 4·5H 2 O 2 / 0.5g ZnSO 4·7H 2 O·h/v 0.5g FeSO 4·7H 2 O·h/v 0.2g MnCl 2·4H 2 O·m/2 完全溶解，使用纳米纯水将最终体积调节至100 ml。使用0.2μM过滤器过滤灭菌。

Luria Bertani（LB）琼脂平板
将以下成分在1L纳米H 2 O 2和高压釜
中混合 5g酵母提取物
5克NaCl
10g胰蛋白胨
15g BD Bacto ^TM琼脂
聚集琼脂平板（修改自[Overhage等人，2007]）
对于1升培养基（新鲜制备）：
3.6克葡萄糖 5克酪蛋白氨基酸
100ml磷酸钾缓冲液（配方3a） 5g BD Bacto ^TM琼脂在250 F和20 PSI下高压灭菌20分钟
高压灭菌后，加入：
1ml的20mM MgSO 4（终浓度= 0.02mM）（配方3b）
10ml的1mM FeSO 4（终浓度= 0.01mM）（配方3c）
使用25毫升玻璃移液管，吸取20毫升培养基到每个板。然后将板单独放在台面上，在室温下干燥3-4小时，然后接种。

磷酸钾缓冲液
制备1L的K 2 HPO 4（F.W：174.18）。加入107.99g/1L纳米H 2 O 2 / 制备1L的KH 2 PO 4（F.W：136.09）。加入84.37g/l的纳米级H 2 O 2 / 在1L量筒中混合：
615ml 620mM K 2 HPO 4
385ml 620mM KH 2 PO 4 4/s 缓冲液pH值应为7
1mM FeSO 4
为了制备1mM储备溶液，将0.0559g FeSO 4加至200ml纳米H 2 O 2。过滤灭菌并在4℃下保存
20mM MgSO 4 为了制备20mM储备溶液，将0.9858g MgSO 4加入到200ml纳米H 2 O 2中。过滤灭菌并储存在4°C

致谢

我们感谢俄克拉何马州立大学的Erica Lutter博士，分享设备和有益的讨论。这项工作是由OCAST的研究资助（奖HR12-167）支持。

参考文献

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