材料和试剂

Pyrex玻璃培养皿（150×20mm）（Corning，目录号：3160-152BO）
Pyrex结晶皿（Corning，目录号：3140-150）
Wheaton Coplin染色瓶（Sigma-Aldrich，目录号：S6016）
湿巾纸
针
单刃手术刀片（Sigma-Aldrich，目录号：S2771）
棉签，无菌（6英寸）（Medline Industries，目录号：MDS202000Z）
塑料巴斯德移液管（BRAND，目录号：747755）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
Tricaine（MS222）（Sigma-Aldrich，目录号：E10521）
斑马鱼水族馆系统水
0.1％甲酚紫溶液（Sigma-Aldrich，目录号：C5042）
0.1％luxolfast blue溶液（Sigma-Aldrich，目录号：L0294）
4％多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
0.5M EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
石蜡（Sigma-Aldrich，目录号：327212）
二甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：534056）
0.05％碳酸锂溶液（Sigma-Aldrich，目录号：255823）
分级乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：24102）注意：此产品已停产。
冰乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）

设备

徕卡旋转切片机（Leica Biosystems Nussloch，型号：RM 2125RTS）
Student Dumont＃5镊子（Sigma-Aldrich，目录号：F6521）
微解剖剪刀（Harvard Apparatus，目录号：728500）
立体倍率解剖显微镜（Olympus，型号：SZX7和SZ51）

程序

注意：本研究是根据CPCSEA（动物实验控制和监督委员会，印度政府环境和森林部）提供的指南进行的。手术方案由我们部门的机构动物伦理委员会批准，注册于CPCSEA（CPCSEA/ORG/CH/REG NO.925/295）。

鱼的保养
斑马鱼种群是在我们的动物房设施繁殖或从当地宠物商店获得。在保持在28℃的水生系统中，鱼在14小时光照和10小时黑暗循环下分成15组保持。
手术板的准备
使用106mm玻璃培养皿，并且将潮湿的薄纸放置在其中，其中麻醉的鱼横向放置（图1a;视频1）。鳃由用水或PBS浸泡的薄纸覆盖
将相同大小和年龄（长度约3-4cm，4-6个月大）的鱼通过将其浸入0.02％三卡因（MS222）3-5分钟（长时间暴露如10分钟或更长可能影响后 - 外科手术恢复脊髓损伤的鱼）。重要的是检查鱼在手术前是否完全麻醉。将麻醉的鱼置于培养皿上后，用针触摸身体，没有抽搐运动证实完全麻醉。将麻醉鱼的培养皿置于立体倍率解剖显微镜下，并在显微镜下进行手术。
手术协议

挤压伤：

在背鳍的水平处，在鱼体的第二条上用单刃刀片进行纵向切口，其对应于15/16脊椎（图1b;视频1）。
在进行皮肤伤口（图1c;视频1）之后，必须侧向地刮擦肌肉以到达位于更深的水平的脊柱。可以使用无菌棉签清除进入伤口部位的血液（图1d;视频1）

图1.脊髓损伤前皮肤创伤。将麻醉的成年斑马鱼侧面放置在潮湿的组织纸上，然后施加脊髓损伤; b。背鳍（DF）下面的着色剥离区域（PR）是制造皮肤伤口的区域; C。用锋利的刀片做皮肤伤口; d。使用无菌棉签清除伤口区域的血液; e。使用镊子撕开伤口深处的肌肉，以达到并清楚地看到脊髓
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脊柱是硬的但是半透明的组织，并且被包在椎骨内的脊髓随着脑膜着色而可见。清除周围组织后，用Dumont镊子＃5将椎柱压碎1秒（视频1;图2和图4，其中损伤中心标有星号）。

图2.使用Dumont＃5镊子挤压脊髓损伤。保持镊子拉伸清楚地可视化脊髓之前执行损伤; b。通过使用Dumont＃5镊子从背侧保持全脊髓持续1秒造成挤压伤; C。用肌肉和皮肤覆盖脊椎伤口; d。损伤前伤口内脊髓的放大倍数视图; e。挤压损伤期间伤口部位的脊髓的更高放大视图; F。在伤口损伤后的伤口内的脊髓的更高放大视图。星号表示受伤中心。
可以使用脊柱的骨突并且将背鳍的相应鳍射线标记为标记。我们不能在斑马鱼脊椎中进行椎板切除术，因为我们在小鼠中造成SCI时，因为脊柱在这里太薄了。在完成损伤后，将周围的肌肉组织放回到覆盖损伤部位，并且可以通过皮肤给予单个缝合线以减小伤口尺寸。
将鱼放回培养皿中的浅水中，并使用塑料移液管将水轻轻地吹到鳃上，使得鱼可以快速从麻醉中恢复并且可以自己游泳。鱼最终转移到更大的罐中，并允许在28℃下再生指定的时间段。

横断损伤

类似于挤压伤，在位于背鳍水平处的鱼体的第二条上用单刃刀片在皮肤上横向给予纵向切口，其对应于15/16支椎骨。
在仔细刮除伤口下方的肌肉后，包在脊柱中的脊髓可以清楚地可视化。在到达伤口部位深处的脊柱时，使用微解剖弹簧剪刀完全横断脊髓（图3和图4）。
由于脊髓是软的海绵组织，通过微型剪刀的两个刀片穿过两个椎骨之间的间隙的锋利切口足以确保完全横断使得嘴侧和尾侧残端完全彼此分离。在图4c中用星号标记损伤中心。损伤会导致身体后部瘫痪。在完成损伤程序后，将周围的肌肉组织放回以覆盖脊椎伤口。缝线可以通过皮肤给予（图S1 ）或组织胶（可选）以减少伤口尺寸。鱼返回浅水池，用塑料移液管轻轻地将水吹到鳃上，以便鱼能快速从麻醉中恢复。
鱼最终转移到更大的罐中，并允许在28℃下再生指定的时间段

图3.使用微型剪刀对脊髓的横切损伤。将镊子保持在打开位置以在造成伤害之前清楚地观察脊髓; b。通过使用细弹簧剪刀将脊髓完全切断成喙和尾骨，执行横切损伤; C。用肌肉和皮肤覆盖脊椎伤口; d。损伤前脊髓的放大倍率视图; e。横断损伤时脊髓的放大视图; F。横断损伤后脊髓的放大视图。星号表示受伤中心。

图4.挤压和横切损伤后未受伤和受伤的脊髓。未受伤的脊髓的放大图片。 b。挤压伤后脊髓的放大图片。 C。横断面损伤后脊髓的放大图像。星号表示受伤区域。 SC =脊髓，VC =脊柱

损伤后研究时程的组织学分析
根据标准Klüver-Barrera方案（Sheehan和Hrapchak，1980）对脊髓组织切片进行Luxol快速蓝色和甲酚紫染色（0.05％碳酸锂溶液和冰醋酸用于分化步骤）。将未损伤的和受伤的鱼都解剖，取出脊髓，在4％多聚甲醛中固定，在0.5M EDTA中脱钙，通过梯度酒精和二甲苯并包埋在石蜡中（Hui等人，2010）。未受伤的线中染色切片的时间过程分析显示白质和灰质的相对分布，如图5a所示。在白质中的亚依赖性和轴突和细胞体中的神经元的解剖分布是显而易见的。细胞组分的细节在我们先前的出版物（Hui等人，2010）中讨论。在这里，显示在挤压损伤后的早期阶段（图5b）的实质性组织损失与一些组织保留，挤压损伤模型的特征。时程细胞反应取决于损伤的程度和程度。在这种情况下，由于横断损伤非常干净，没有多少组织丢失，而残端组织非常接近（图5c）。再生是非常令人印象深刻的，与挤压伤相比，时间框架没有多少变化。

图5.脊髓组织中的Luxol快速蓝染色。在损伤后3天（b）和脊髓3天后的未损伤脊髓（a），脊髓的组织切片（c）用luxol快速蓝和甲酚紫染色。请注意，在b损伤震中有一些备用组织，而两个单独的树桩组织在c中清晰可见，没有轴突保留。 GM =脊髓灰质区，WM =脊髓白质区，N =神经元，SEP =亚室管膜，EP =室管膜。星形表示大致的损伤中心。比例尺=100μm（a-c）。

数据分析

损伤方案在我们的实验室中被标准化，其中数百个动物已经用于我们的阵列分析（Hui等人，2014）。我们可以在一天内伤害30-40只动物。所有的组织学分析与脊髓组织重复3-5次。这里显示的图片在其他出版物中不再重复。然而，斑马鱼中再生的时间过程分析先前已经公开（Hui等人，2010， http //www.suklaghosh.com ）。

笔记

已经描述了用于在成年斑马鱼中造成挤压和横切损伤的两种非常简单但标准化的方案。这些损伤模式的再现性可以通过分析用不同染色方案（如luxol fast blue和甲酚紫或马洛里三色染色或甚至常规的苏木精/曙红染色）染色的组织切片来进行。
染色，特别是使用脊髓组织的纵向切片使我们能够表征损伤的性质，并且显示损伤后的损伤中心和邻接区域的细胞反应，并与同一条线的正常部分进行比较。 />

致谢

这里描述的这些损伤方案是在Sukla Ghosh的实验室，Department of Biophysics，Molecular Biology and Bioinformatics，University of Calcutta，Kolkata，India中产生的。从工作收到的资助支持来自DBT（印度政府，BT/PR5489/AAQ/03/245/2004）。 Dr. Subhra Prakash Hui从CSIR（印度政府）获得高级研究奖学金。斑马鱼中的脊髓压伤损伤方案已经从我们以前的出版物改编（Hui等人，2010; 2014）。

参考文献

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Becker，T.，Wullimann，MF，Becker，CG，Bernhardt，RR和Schachner，M。（1997）。在成年斑马鱼中脊髓横切后的轴突再生。 377（4）：577-595。

Egar，M。和Singer，M。（1972）。 37 37（2）：422-430。

Filoni，S.，Bosco，L。和Cioni，C。（1984）。成年斑马鱼脊髓压伤后的细胞反应。 239（11）：2962-2979。

图1显示了一个基于插入文件的插入文件，该插入文件包含了一个文件， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24465396"target ="_ blank">在脊髓再生期间的基因组宽表达谱分析在斑马鱼中鉴定全面的细胞反应。 em> 9（1）：e84212。

Margotta，V.，Fonti，R.，Palladini，G.，Filoni，S.and Lauro，GM（1991）。组织技术的理论与实践 Battelle 。

Sîrbulescu，RF和Zupanc，GK（2011）。脊柱在具有再生能力的脊椎动物中的脊髓修复：成体硬骨鱼作为模型系统。 Brain Res Rev 67（1-2）：73-93。

Thuret，S.，Moon，LD和Gage，FH（2006）。脊髓损伤后的治疗性干预。 Nat Rev Neurosci 7（8）：628-643。