材料和试剂

超声离心管（Beckman Coulter，目录号：349623）
比色杯（100μl）（Beckman Coulter，目录号：523270）
注意：此产品已停产。
拟南芥生态型Col-0
二硫苏糖醇（DTT）（NACALAI TESQUE，目录号：14128-04）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（NACALAI TESQUE，目录号：273-27）
亮光素（Wako Pure Chemical Industries，目录号：126-03754）
MOPS（NACALAI TESQUE，目录号：23415-54）
寡霉素（Sigma-Aldrich，目录号：75351）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
乙二胺-N，N，N'，N'-四乙酸（EDTA）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：N001-10）
氟化钠（NaF）（NACALAI TESQUE，目录号：31420-82）
Tris（NACALAI TESQUE，目录号：35406-91）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（NACALAI TESQUE，目录号：21623-26）
硫酸镁（MgSO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：131-00405）
氯化钾（KCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
硝酸钾（KNO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：160-04035）
钼酸铵（Wako Pure Chemical Industries，目录号：016-06902）
Triton X-100（Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-21105）
ATP（NACALAI TESQUE，目录号：10406-61）
原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
SDS（NACALAI TESQUE，目录号：31607-65）
钼酸钠（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-02472）
硫酸（H 2 SO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-04696）
1-氨基-2-萘酚-4-磺酸（ANSA）（NACALAI TESQUE，目录号：02212-12）
亚硫酸氢钠（NaHSO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：190-01375）
硫酸钠（Na 2 SO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-03415）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-04245）
DTT储备溶液（见配方）
蛋白酶抑制剂溶液（参见配方）
寡霉素溶液（见配方）
均质缓冲液（参见配方）
2x ATPase缓冲液（见配方）
ATPase反应缓冲液（参见配方）
ATP溶液（参见配方）
钒酸盐溶液（参见配方）
停止解决方案（参见配方）
ANSA解决方案（参见配方）
Pi标准储备溶液（见配方）

设备

砂浆（直径90mm）和研钵
冷冻离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-307）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：OptimaTM TLX）
Vortex（科学工业，型号：SI-0286）
热块（TAITEC，型号：e-ThermoBucket ETB）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU 730）
注意：此产品已停产。

程序

微粒体膜的制备
1. 在23℃下在白光（50μmol光子m -1 -2 s -1 s -1 -1 ）下在土壤中生长拟南芥 3周， -h光/8小时黑暗周期。
2. 用研钵和研杵在2ml冰冷的匀浆缓冲液中匀化玫瑰花叶（约100mg），并保持在冰上。
3. 在4℃下将匀浆在13,000×g离心10分钟
4. 在4℃下将上清液在100,000xg下超速离心1小时
5. 通过上下吹吸，将沉淀重悬在100μl冰冷的匀浆缓冲液中
6. 通过Bradford测定法（Bradford，1976）定量蛋白质浓度
7. 用匀浆缓冲液将蛋白质浓度调整至0.45μg/μl 注意：将微粒体膜保存在冰上直到使用。
钒酸盐敏感性ATP水解活性的测量
1. 混合100微升的微粒体膜与100微升ATP酶反应缓冲液，分开混合物在两个管，每个90微升（20微克蛋白质），并保持在冰上。
2. 为了确定钒酸盐敏感性ATP酶活性，将2μl钒酸盐溶液加入一个试管中，并向另一试管加入等体积的1×ATP酶缓冲液。
3. 加入10μlATP溶液，轻轻涡旋
4. 在30℃孵育30分钟。孵育15分钟后轻轻涡旋一次。
5. 加入1ml终止液。
6. 加入50μlANSA溶液，轻轻涡旋
7. 在24℃孵育30分钟。孵育15分钟后轻轻涡旋一次。
8. 使用比色杯通过分光光度计测量750nm处的吸光度注意：不要离心样品。
制备Pi标准曲线
1. 准备Pi稀释系列，如表1所示。
  
  表1.用于准备Pi标准曲线的模板
2. 加入50μlATP酶反应缓冲液和1ml终止液
3. 加入50微升ANSA溶液，并在24°C孵育30分钟。孵育15分钟后轻轻涡旋一次。
4. 使用比色杯测量750nm处的吸光度并制作标准曲线（图1）。

数据分析

典型的Pi标准曲线如图1所示。使用标准曲线计算样品的Pi含量。钒酸盐敏感性ATP水解活性通过从不存在钒酸盐的条件下减去钒酸盐存在下的P 1含量来确定，并表示为nmol Pi/h/mg蛋白质。

计算Pi标准曲线的斜率。
A <750> = 0.0038（Pi含量[nmol]）+ 0.0088
从斜率确定样品的Pi含量（Pi含量[nmol]）=（A 750〜0.0088）/0.0038
在没有钒酸盐的情况下，从钒酸盐的存在中减去Pi含量
除以蛋白质的量（mg）和反应时间（h）。以下是计算示例。
在钒酸盐不存在下的Pi含量= 10nmol
在钒酸盐存在下的Pi含量= 5nmol
反应时间= 0.5小时（30分钟）
蛋白质量= 0.02mg（20μg）
钒酸盐敏感性ATP水解活性（nmol Pi/h/mg蛋白质）
=（[不存在钒酸盐时的Pi含量] - [钒酸盐存在时的Pi含量]）/（反应时间）/（蛋白质量）
=（10-5）/0.5/0.02=500nmol Pi/h/mg蛋白质

图1.使用已知量的Pi产生的标准曲线。测量750nm处的吸收。

食谱

DTT储备液
1 M DTT在无菌水中
以小量等分试样保存于-20°C
蛋白酶抑制剂溶液
200mM PMSF和4mM亮抑酶肽的DMSO溶液在4℃下以小等分保存
寡霉素溶液
5mg/ml寡霉素的DMSO溶液以小量等分试样保存于-20°C
均匀化缓冲液
50mM MOPS-KOH（pH7.5） 100 mM NaCl
2.5mM EDTA
10mM NaF 5 mM DTT
1mM PMSF
20μM亮肽素储存于4°C。在使用前加入NaF，DTT，PMSF和亮抑酶肽
2x ATPase缓冲液
60mM Tris-MES（pH6.5） 6mM MgSO 4 100 mM KCl
200mM KNO 3
存储在4°C
ATPase反应缓冲液（新鲜制备）
2x ATP酶缓冲液，补充有：
1mM钼酸铵 10μg/ml寡霉素 0.1％（w/w）Triton X-100 0.5 mM PMSF
10μM亮肽素
ATP溶液
20mM ATP，在1x ATP酶缓冲液中溶液应小份分装，以避免冻融，并可在-80℃下储存至少6个月。
钒酸盐溶液（新鲜制备）
10mM原钒酸钠的1x ATP酶缓冲液中
停止溶液（新鲜制备）
1.3％（w/v）SDS
0.25％（w/v）钼酸钠 0.3 N H 2 SO 4子< br />
ANSA解决方案（新鲜制备）
0.125％（w/v）1-氨基-2-萘酚-4-磺酸（ANSA） 15％（w/v）NaHSO 3·
1％（w/v）Na 2 SO 4 4 /
Pi标准储备溶液（新鲜制备）
5mM KH 2 PO 4 sub/

致谢

该协议改编自Okumura等人。（2016年）。这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部科学研究助理（15H05956和15H04386到TK）和JSPS研究员资助（253307到MO）。

参考文献

Bradford，MM（1976）。快速敏感的方法用于利用蛋白质 - 染料结合原理定量微克数量的蛋白质。 Anal Biochem 72（1-2）：248-254。
Kinoshita，T.，Nishimura，M.and Shimazaki，K.（1995）。 Ca 2+的胞质浓度调节蚕豆保卫细胞中的质膜H sup + -ATPase。植物细胞 7（8）：1333-1342。

Okumura，M.，Inoue，S.，Kuwata，K.and Kinoshita，T.（2016）。光合作用通过糖积累激活质膜H ⁺ -ATPase 植物生理学171（1）：580- 589.

Shimazaki，KI和Kondo，N。（1987）。 + -ATP酶。植物细胞生理学 28（5）：893-900。

Uemura，M。和Yoshida，S。（1986）。研究植物细胞中的冻伤：II。在体内致死冷冻期间，菊芋块茎的质膜中的蛋白质和脂质变化。植物生理学80（1）：187-195。