材料和试剂

对于初始外植体

解剖材料：2无菌镊子，2无菌镊子，1无菌剪刀，2无菌手术刀
一次性手术刀（Aspen Surgical，目录号：371621）
每个样品四个60mm组织培养皿（Corning，目录号：430589）
注射器，10ml
注射器过滤器，0.22μm孔
500ml过滤单元，0.22μm孔（EMD Millipore，目录号：SCGPU01RE）
parafilm
铝箔
2.5％的avertin-2,2,2-三溴乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：T48402-25g）以粉末形式，通过将25g 2,2,2-三溴乙醇溶解在25ml的2-甲基-2-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：240486-100ML），然后稀释至2.5％的无菌水溶液。储备溶液和稀释液都对光敏感，因此应在4℃的黑暗中储存。
70％乙醇
含有钙和镁的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GE Healthcare，Hyclone ，目录号：SH30028.02）
主动脉活检储存介质组分：

Waymouth's MB 752/1培养基，500ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11220035）
抗生素 - 抗真菌的100x（Sigma-Aldrich，目录号：A5955）
L-谷氨酰胺，100x（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8761）
MEM非必需氨基酸（Sigma-Aldrich，目录号：M7145）
HEPES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）

1型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C1639）
弹性蛋白酶，来自猪胰腺的1型胰腺（Sigma-Aldrich，目录号：E1250）
大豆胰蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：17075-029）
热灭活的胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals）
SmBm子弹试剂盒（Lonza，目录号：CC3182）

FGF
EGF
胰岛素
庆大霉素和包括FBS - 不要使用！

继续培养

500ml过滤单元，0.22μm孔（EMD Millipore，目录号：SCGPU01RE）
冷冻小瓶（2 ml）
胎牛血清（FBS，Atlanta Biologicals）
抗生素 - 抗真菌的100x（Sigma-Aldrich，目录号：A5955）
SmBm子弹试剂盒（Lonza，目录号：CC3182）
1. FGF
2. EGF
3. 胰岛素
注意：该试剂盒包括一管庆大霉素和25毫升FBS的等分试样，这是本协议的任何步骤不需要。请不要使用它们！有关更多信息，请参阅下面的"制备试剂"，了解不使用庆大霉素或提供的FBS的SmBm完全培养基的制备。
TrypLE express（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12604013）
DMSO

用于免疫荧光以证实SMC身份

盖玻片（紫外线处理，详情请参阅下面的数据分析部分）
6孔板
血细胞计数器
3-6只小鼠，优选4-6周龄的
SmBm基础培养基（Lonza，目录号：CC3181）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals）
重组人TGF-β1（rhTGF-β1，R& D Systems）
16％甲醛（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，目录号：28906）。在含有钙和镁的DPBS中稀释1至4，最终浓度为4％
封闭缓冲液（0.3％Triton X，0.5％BSA的DPBS溶液）
DPBS
平滑肌α-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A5228）
抗小鼠第二抗体与荧光结合
使用DAPI（Vectashield，目录号：H-1200）

主动脉活检储存介质（见配方）
完成平滑肌介质（见配方）
平滑肌细胞冷冻介质（见配方）
消化酶混合物（见配方）

设备

注意：实验的再现性不取决于这些设备的具体品牌或型号。任何显微镜，组织培养罩/孵化器，离心机等，将给出类似的结果。

磁力搅拌器
解剖显微镜
无菌组织培养罩
无菌组织培养孵化器
10ml移液管
水浴
台式离心机
200μl移液器
T25烧瓶
T75瓶
缓慢冷冻容器（泡沫容器或异丙醇容器将工作）
血细胞计数器
倒置显微镜
热珠灭菌器

程序

试剂的制备
1. 要制作主动脉活检储存介质，加入以下瓶500毫升。 Waymouth的MB 752/1中等。
  1. 5ml抗生素/抗真菌剂
  2. 6.25ml L-谷氨酰胺
  3. 15ml碳酸氢钠
  4. 5ml MEM非必需氨基酸
  5. 5ml HEPES缓冲液
  注意：请注意，我们不会删除任何基础培养基以补偿添加剂的添加。因此，主动脉活检储存介质的最终体积为536.25ml。介质可以在4°C下储存长达6个月，或者直到瓶子上的制造商到期日期，以较早者为准。
2. avertin溶液的制备
3. 为了制备完全平滑肌肉培养基（SmBm完全），通过0.22μM真空过滤器过滤以下，并加入到一瓶500ml来自Lonza的SmBm基础培养基中。该培养基可以在4℃下储存长达2个月，或者直到瓶子上的制造商的有效期，以较早者为准。重要的是要注意，不应该添加包含在SmBm弹头套件中的庆大霉素的等分试样。
  1. 100 ml FBS
  2. 子弹试剂盒中含有的FGF的等分试样（1ml）
  3. 子弹试剂盒中含有的EGF的等分试样（0.5ml）
  4. 子弹试剂盒中含有的胰岛素的等分试样（0.5ml）
  5. 5ml抗生素/抗真菌剂
  注意：我们不删除任何基础培养基以补偿添加剂的添加。因此，SmBm完全的最终体积为607ml。
4. 消化酶和其他试剂的制备
解剖小鼠以去除主动脉组织
1. 通过腹膜内（IP）注射2.5％的avertin麻醉实验小鼠（3-6只小鼠/外植体）。每个小鼠使用0.5毫升的溶液。要确定何时麻醉有效，捏紧鼠标的脚趾之间你的指甲之间。如果鼠标踢或反应根本，麻醉是不完整的。等待几分钟，再次测试，直到没有对脚趾捏的反应。如果麻醉在5-7分钟后仍然不完全，您可以再次给小鼠再次加入0.3ml的阿佛丁。
2. 将鼠标放在光源下进行解剖。
3. 将鼠标的皮肤从腹部切到胸部顶部。
4. 用镊子提起胸骨，切开膈肌。然后切下肋骨的下部暴露心脏，去除肺和胸腺，并切除食道，暴露沿脊柱运行的主动脉。请参见图1和视频1.
  
  图1.鼠标胸腔。图片显示胸部打开后的鼠标。蓝色表示肺组织，绿色表示胸腺组织，为了更好地接近心脏和主动脉，必须将两者去除。
  
  <！ - flashid2045v132开始 - >
  视频1.打开小鼠胸腔和切除组织。此视频显示从小鼠胸腔开口到清除肺和气管的解剖的第一部分。
  
  <！ - flashid2045v132结束 - >
5. 将鼠标放在解剖显微镜下。
6. 取出剩余的组织，并使用显微切割剪刀或镊子清除心脏，升主动脉及其分支顶部周围的所有脂肪。见图2.
  
  图2.鼠标中暴露的心脏和降主动脉。图片显示胸部打开并且肺，胸腺和其他组织被移除后的鼠标。红色箭头表示心脏，应该被轻轻拉起以暴露升主动脉和颈动脉分支。红色箭头表示降主动脉，应该夹在隔膜下面。
7. 用镊子轻轻拉起心脏，不打破升主动脉。使用镊子或剪刀轻轻地分离降主动脉从脊柱。夹住膜片下方的降主动脉。夹住颈动脉释放升主动脉。参见视频2.将心脏，升序和降主动脉放在一个60毫米的培养皿中，连接无菌DPBS。
  
  <！ - flashid2045v133开始 - >
  视频2.删除鼠标心脏和主动脉。此视频显示解剖的第二部分：去除心脏和主动脉。
  
  <！ - flashid2045v133结束 - >
8. 将盘放在解剖显微镜下，并从升主动脉和降主动脉中删除任何脂肪或结缔组织。参见图3.通过在左颈总动脉的原点的远端切割来分离升主动脉和降主动脉。根据主动脉的区域和小鼠的基因型，将升高和降主动脉分别置于新的具有DPBS标记的培养皿中。
9. 工作快速但仔细，重复每个实验鼠，直到所有的组织已经分离。每个外植体的升主动脉升主动脉和降主动脉。
10. 将所有的主动脉组织皿移至组织培养罩。
  
  图3.解剖主动脉的外观。整个安装图像显示主动脉组织，它已从鼠标中移除并完全清洁。升主动脉标有红色箭头。
解剖组织
注意：请注意，协议其余部分的所有步骤都应在组织培养罩下使用标准无菌组织培养技术进行。
1. 准备酶混合物
  1. 在开始解剖小鼠之前，在4℃下将胶原酶和胰蛋白酶抑制剂各解冻一等份。
  2. 对于每个外植体，使用5ml主动脉活检存储介质。如果你在白天进行3-4小时消化，添加250微升胶原酶，100微升胰蛋白酶抑制剂和324微升*弹性蛋白酶为每5毫升主动脉活检存储介质。对于过夜（15-18小时）消化，使用1:10稀释因此25μl胶原酶，10μl胰蛋白酶抑制剂和32.4μl*弹性蛋白酶。
    注意：添加的弹性蛋白酶的量基于瓶的质量和体积计算。如果您从不同来源订购弹性蛋白酶，则需要重新计算要添加的酶的量。
2. 将70％乙醇，DPBS和主动脉活检存储介质倒入三个单独的60mm组织培养皿中。
3. 使用镊子，从每个隔离的主动脉从其存储管和洗涤组织在乙醇，然后DPBS，然后活检介质。不要将组织留在乙醇中超过约10-15秒，但留在DPBS或介质中更长时间是可以的。
4. 将每片组织放入60毫米组织培养皿的盖子。使用手术刀和镊子，将组织切成小块 - 确保沿周向和纵向切割组织，以增加暴露于消化混合物的表面积。这些块的尺寸可以变化，但是平均尺寸应该是1-2mm的直径。
5. 将切碎的组织片放入一个新的60毫米组织培养皿，其中含有5毫升培养基加上消化酶混合物在步骤C1中制成。标记菜肴。
6. 将培养皿放入培养箱（37℃）。如果进行3-4小时消化，在2小时和之后每30分钟检查。如果做过夜消化，离开过夜，在15小时和之后每小时检查。
7. 当组织看起来大部分消化与几个浮动单细胞，但仍然一些大块组织，吸管上下组织和媒体5-10次使用10毫升移液管帮助释放组织细胞。放回孵育器30多分钟。另外，从冰箱中取出过滤的FBS以升温至室温，将完全SmBM培养基置于水浴中，升温至37℃。
8. 在孵育时间结束时，在显微镜下观察组织，以确保细胞没有组织。参见图4.如果组织已经被良好消化（应当仍然有一些完整的组织片），加入2.5ml血清和移液管上下约5次。接下来加入2.5ml完全SmBM培养基和吸移管上下〜5次。
  
  图4.消化组织的外观。消化后的菜的照片，有一些"网状"组织漂浮在其中（黑色箭头），但大部分组织片被消化。
9. 转移组织培养皿（应总共10毫升）的整个内容到一个15毫升管。
10. 在室温下以180×g离心5分钟（在Sorvall Legend T +台式离心机中约700rpm）5分钟。
11. 仔细检查，看看是否有任何浮动的组织片在管中。如果是这样，使用200μl移液器取出组织片，并将其直接放入带有完整SmBm的标记T25烧瓶。一旦没有组织块漂浮，删除上清液，并将沉淀重悬在5ml的完整的SmBM培养基中。
  注意：如果上清液混浊，重复步骤C10和C11，直到上清液澄清。如果上清液清澈，则进行步骤C12。
12. 转移5毫升完全SmBm与重悬细胞到标记的T25烧瓶。将烧瓶置于培养箱中。
13. 让细胞沉降并粘附在烧瓶上。不要更换介质至少48小时。如果细胞在这一点仍然没有沉降，不要删除任何介质，并加入2毫升培养基的烧瓶。让细胞再定居1到2天。
小鼠血管平滑肌细胞的维持和传代培养
1. 一旦SMC成长，每3-4天给细胞补充新鲜培养基。
2. 当细胞达到约70％汇合时，或当一些区域开始变得非常紧密包装并且几乎过度生长时，细胞准备分裂。参见图5.将SMC从一个T25烧瓶传送到一个T75烧瓶。
3. 当SMC已经扩增时，可以冷冻细胞等分试样。按照上述用于传代SMC的方案中的步骤D2a-D2i。一个T75瓶可以分成2个冷冻细胞等分试样。一个融合的T75瓶应该有大约200万个细胞，所以每个冷冻瓶将有大约1百万个细胞。离心后，按照以下步骤冻结细胞。
  1. 吸出上清液，重悬细胞沉淀在3毫升SMC冷冻介质（见Recipes）。
  2. 转移1.5毫升具有溶解沉淀的冷冻介质到两个冷冻管中的每一个。冷冻库应该用通道数，冷冻日期和细胞系标记。
  3. 将冷冻管放入缓慢冷冻的容器（泡沫容器或异丙醇容器将工作），并在-80℃冰箱过夜冷冻。
  4. 将冷冻的等分试样转移到液氮储存系统中长期储存。
4. 当您想解冻SMC等分试样时，通常可将一小瓶冷冻细胞解冻至一个T75烧瓶。

数据分析

SMC表型的表征
为了确认SMC的身份，执行平滑肌α-肌动蛋白的免疫荧光，应在分化SMC的丝中可见。当细胞是80％汇合时，它们准备平板。在开始使用细胞前一小时，将盖玻片放入6孔板（每孔一个盖玻片，您想要盖板的数量，对于本实验，我们建议至少两个）在细胞培养罩下。打开罩在罩中的UV至少30分钟，以消毒盖玻片。然后开始，按照步骤D2a-D2i传代上面的细胞。离心后，吸出上清液，并在较小体积（通常为2ml的SmBm完全）中重悬细胞沉淀。
1. 使用10μl重悬细胞混合物计数血细胞计数器中的细胞
2. 计算5,000个单元格所需的体积。将计算体积的细胞混合物加入含有盖玻片的孔中，并向每孔加入额外的SmBm完全培养基至2ml体积。任何剩余的细胞可用于其他实验或根据需要放回烧瓶中
3. 18-24小时后，电镀细胞，更换培养基到低血清SmBm培养基，其驱动血管SMC的分化。这是SmBM基础培养基，仅添加1％FBS和1x抗生素/抗真菌剂（对于500ml的SmBm基础培养基瓶，加入5ml FBS和5ml的100x抗生素/抗真菌剂）。在细胞上留下低血清SmBm至少24小时
4. 如果需要，您可以用rhTGF-β1处理一些盖玻片以进一步诱导分化。切换至低血清SmBm培养基24小时后，向低血清SmBm培养基中加入10ng/ml rhTGF-β1，并将该培养基加入盖玻片中。将含有rhTGF-β1的培养基保留在细胞上48小时
5. 当进行处理时，除去培养基，用DPBS洗涤细胞一次，并向每个孔中加入1ml的4％多聚甲醛溶液以固定细胞。储存在4°C，直到细胞准备染色。
6. 对于染色，使用50μl液体的每个盖玻片在Parafilm上，并将盖玻片倒转到液滴以节省抗体。首先，在封闭缓冲液中孵育盖玻片1小时（封闭缓冲液是0.3％Triton-X，0.5％BSA在DPBS中）。
7. 在DPBS中洗涤盖玻片3次5分钟
8. 孵育盖玻片在1：500抗平滑肌α-肌动蛋白抗体在封闭缓冲液中在4℃过夜。
9. 在DPBS中洗涤盖玻片3次5分钟。
10. 孵育盖玻片在1：500荧光缀合的抗小鼠IgG二抗在封闭缓冲液在室温下3小时。
11. 在DPBS中洗涤盖玻片3次5分钟
12. 使用DAPI（核复染，Vectashield）的安装介质将盖玻片安装到显微镜载玻片上
13. 使用指甲油或其他所需的密封剂将盖玻片密封到载玻片上。
14. 使用所需的荧光显微镜评估染色。至少95％的细胞应该具有在细胞中可见的平滑肌α-肌动蛋白丝（图6）
  
  图6.在分离的平滑肌细胞中的肌动蛋白丝。SMα-肌动蛋白（绿色）的免疫荧光染色显示SMα-肌动蛋白的聚合丝。核用DAPI（蓝色）复染色

笔记

正确计时乙醇洗涤步骤（上述"外植体"方案下的步骤C3）是关键的。太长时间在乙醇会杀死细胞，并大大降低成功。在乙醇洗涤中的时间过短可能导致样品的细菌污染。
虽然上面列出的消化酶的产品编号已经在我们手中广泛测试，我们也已经成功与其他版本的胶原酶和弹性蛋白酶。最关键的因素是活性酶的浓度和消化的时间。任何替代酶将需要测试最佳消化时间
通常，在我们的手中，初级平滑肌细胞在培养中保持其表型至少6代。我们总是使用低通过细胞（

食谱

主动脉活检存储介质
500ml Waymouth's MB 752/1培养基
5ml的100×抗生素 - 抗真菌剂
6.25ml L-谷氨酰胺 15ml碳酸氢钠 5ml MEM非必需氨基酸
5ml HEPES缓冲液
完成平滑肌介质
500 ml SmBm基础培养基
100ml FBS
1ml的FGF包含在子弹套件
中 0.5ml包含在子弹套件
中的EGF 0.5ml包含在子弹套件中的胰岛素
5ml抗生素/抗真菌剂
平滑肌细胞冷冻介质
45 ml完全平滑肌介质
5ml过滤的FBS 5ml无菌DMSO
消化酶混合物（3-4小时消化时间）
5ml主动脉活检储存介质
250μl胶原酶
100μl胰蛋白酶抑制剂
324μl弹性蛋白酶

致谢

这项工作得到国家卫生研究院的支持：NIH（RO1 HL62594和P01HL110869-01），John Ritter基金会，Vivian L. Smith基金会和Ehlers Danlos综合征网络。该方法在Kuang等人中公开。（2016），并且它是Gordon等人使用的方法的改编。（1986）和Lemire等人。（1994）。使用该方法移出的细胞也用于以下出版物中：Cao等人。（2010），Kuang等人。（2012），Kwartler等人。（2014），Papke等人。（2013年）。

参考文献

Cao，J.，Gong，L.，Guo，DC，Mietzsch，U.，Kuang，SQ，Kwartler，CS，Safi，H.，Estrera，A.，Gambello，MJ和Milewicz，DM（2010）结节性硬化综合征中的胸主动脉疾病：分子发病机制和潜在疗法Tsc2 +/- mice。 Hum Mol Genet 19（10）：1908-1920。
Gordon，D.，Mohai，LG和Schwartz，SM（1986）。在新生大鼠主动脉平滑肌细胞培养物中诱导多倍体。 Circ Res 59（6）：633-644。

Kuang，SQ，Kwartler，CS，Byanova，KL，Pham，J.，Gong，L.，Prakash，SK，Huang，J.，Kamm，KE，Stull，JT，Sweeney，HL和Milewicz，DM（2012）。平滑肌特异性同种型中的罕见，非同义变体肌球蛋白重链，MYH11，R247C，改变主动脉中的力产生和平滑肌细胞的表型。 Circ Res 110（11）：1411-1422。