材料和试剂

10cm 培养皿（Corning，目录号：353003）
解剖板（Sigma-Aldrich，目录号：P7741）
1.5ml反应管（SARSTEDT，目录号：72.706.700）
外科手术刀刀片号11（Sigma-Aldrich，目录号：S2771）
26号针（BD，PrecisionGlide TM ，目录号：305110）
Amersham Protran Premium 0.2 NC（GE Healthcare，目录号：10600004）
HEK293细胞
C57BL/6小鼠品系（或任何其他小鼠模型，两种性别）
pAcGFP1-C1载体（Takara Bio，Clontech，目录号：632470）
FLAG-PSD-95质粒DNA（Craven等人，1999）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖，GlutaMAX补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10566016）
10％胎牛血清（FBS）
聚乙烯亚胺，线性（PEI）（Polysciences，目录号：23966-2）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140148）
不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
磷酸酶抑制剂混合物1（Sigma-Aldrich，目录号：P2850）
来自小鼠血清的IgG（Sigma-Aldrich，目录号：I8765）
抗FLAG（克隆M2）（Sigma-Aldrich，目录号：F9291）
磷酸 - 丝氨酸/苏氨酸 - 脯氨酸MPM2抗体（EMD Millipore，目录号：05-368）
蛋白G Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare，目录号：17-0618-01）
PageRuler TM 预染蛋白梯（Thermo Fisher scientific，Thermo scientific TM ，目录号：26616）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
山羊抗小鼠HRP缀合的IgG（EMD Millipore，目录号：12-349）
ECL检测试剂（GE Healthcare，目录号：RPN2209）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：7558-79-4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：7778-77-0）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
原钒酸钠（Na 3 VO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
氟化钠（NaF）（Sigma-Aldrich，目录号：201154）
TEMED（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）（Sigma-Aldrich，目录号：A2792）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）（参见配方）
MPM-2裂解缓冲液（参见配方）
磷酸酶抑制剂（参见配方）
IP洗涤缓冲液（参见配方）
2x Laemmli样品缓冲液（参见配方）
蛋白质印迹运行缓冲液（参见配方）
Western印迹转移缓冲液（参见配方）
Tris缓冲盐水-Tween 20（TBS-T）（参见Recipes）
BSA封闭溶液（见配方）

设备

尼康Diaphon 300相位倒置组织培养显微镜
细胞刮刀（Sigma-Aldrich，目录号：C5981）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5424R）
孵化器（Panasonic Biomedical Sales Europe，型号：MCO-18AC-PE）
DNA超声仪（EpiShear，型号：冷却超声平台）
旋转混合器（Scilogex，型号：MX-RD-Pro LCD数字管旋转混合器）
组织匀浆器（Thomas Scientific，目录号：3409Y72）
冷室，4°C
聚丙烯酰胺凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658000EDU）
Western印迹转移装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Trans-Blot Cell）

软件

Alliance 4.7软件（UVITECH）
UVI波段成像仪软件

程序

FLAG-PSD-95在HEK293中异位表达
1. 将HEK293细胞在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养。
2. 10cm 2培养皿用2μgFLAG标记的PSD-95使用PEI转染方法转染。特别地，在转染前一天铺板1.8×10 6个细胞。将总质粒DNA在500μl无血清DMEM（w/o）酚红中稀释。然后以7：1的比例（μgPEI：μgDNA）将PEI（1μg/μl）加入到稀释的DNA中。将混合物在室温下温育20分钟并逐滴加入。转染后48小时收获细胞。通过同时共转染500ng pGFP-C1（编码绿色荧光蛋白的载体DNA）来评估转染效率。表达GFP的细胞通过荧光显微镜直接观察。
3. 取出培养基，用冰冷的PBS洗涤两次细胞培养皿
4. 使用细胞刮刀从培养皿上刮下贴壁细胞，然后将细胞悬浮液轻轻转移到新鲜的预冷却的1.5ml反应管中。
5. 在4℃下以13,500×g离心10分钟（冷冻离心机）。弃去上清液并收集沉淀。
6. 机械地将沉淀物重悬在补充有蛋白酶（cOmplete TM无EDTA抑制剂混合物）和磷酸酶抑制剂（参见Recipes）的700μlMPM-2裂解缓冲液中。
7. 孵育裂解物30分钟，在4℃下旋转
8. 超声裂解物，每次10秒的三次短脉冲，随后30秒的间隔冷却。保持裂解物在任何时候在冰上，避免起泡注意：超声处理主要用于剪切DNA/RNA，使裂解液粘度逐渐降低。
9. 在4℃下以13,500×g离心10分钟（冷冻离心机）。
10. 将上清液移入新鲜的反应管中，弃去沉淀
内源性PSD-95从小鼠脑
1. 根据实施欧洲委员会理事会指令（2010/63 EEC）的意大利动物福利立法（D.L. 26/2014）牺牲小鼠。这些程序由当地兽医当局和SISSA的伦理委员会批准。在诱导无意识的CO 2暴露后，用锋利的外科剪刀将产后天（P）10-P15动物（雄性和雌性）断头。将脑从颅骨中快速移出，在冰冷的PBS中冲洗，转移至冰冷的解剖板，并使用外科手术刀刀片（11号）切碎。将破碎的组织在4℃下使用组织匀浆器匀浆化，在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（如上）的MPM-2裂解缓冲液中设置500rpm 10次。对于每50mg脑组织，加入400μl裂解缓冲液以获得10至20mg/ml的最佳蛋白质浓度。对于体重约300-350mg的P15小鼠脑，加入3.0ml裂解缓冲液
2. 孵育组织匀浆30分钟-1小时在4°C与旋转。
3. 如前所述进行超声处理，并通过26号针均匀地通过几次
4. 在4℃下以13,500xg离心10分钟。
5. 轻轻地从离心机中取出反应管，移出上清液，并将其分成两个1.5ml在冰上预冷却的新鲜反应管;丢弃颗粒。
磷酸 - 丝氨酸/苏氨酸 - 脯氨酸免疫沉淀
1. 保存30μl的细胞裂解液或匀浆作为起始材料（输入）在SDS-PAGE分析中测试和5.0μl，以确定蛋白质浓度。
2. 将剩余的裂解物等量分成用于MPM-2免疫沉淀的两个新鲜反应管和作为对照样品的正常小鼠IgG（每个管中约1-1.5mg总蛋白）。
3. 向适当的反应管中加入2μg的MPM-2抗体和2μg的对照小鼠IgG。
  注意：在初步实验中必须滴定MPM-2抗体/总蛋白输入的适当比例，考虑到所研究的蛋白质的表达水平和存在的假定的pS/pT-P共有基序的数目
4. 在4℃下温和旋转孵育3小时注意：与MPM-2抗体的孵育时间遵循上述相同的理论（步骤C3）。如果目的蛋白质表达不佳，建议过夜孵育。
5. 向每个样品中加入100μl（50％珠/缓冲液）平衡到MPM-2裂解缓冲液中的Protein-G Sepharose珠。
  注意：为了平衡珠子，向珠子中加入MPM-2裂解缓冲液，在管中混合数次，旋转珠子，除去上清液（两次）。
6. 通过在4℃下温和旋转孵育另外2小时，下拉结合到蛋白-G琼脂糖珠上的抗体 - 抗原复合物。
7. 用裂解缓冲液洗涤珠子三次。
  注意：对于洗涤珠，向珠中加入缓冲液，混合管数次，旋下珠，并除去上清液。
8. 最后一次洗涤后，吸出上清液，通过加热至95-100℃5分钟，用50μl2×Laemmli样品缓冲液洗脱蛋白质。样品可以立即加载到凝胶上或保存在-80℃冷冻以备以后运行。
9. 使用SDS-PAGE和Western印迹分析样品。
  将20μg起始材料（输入），50μlIP样品和7μl预染色的蛋白梯度加载到SDS-PAGE凝胶（10×10cm）上。
  注意：在Western印迹分析中检测MPM-2的情况下，建议进行2小时转移，以尽量减少或避免翻译后修饰的丢失。
10. 使用靶特异性抗体或MPM-2抗体检测免疫沉淀的蛋白质注意：对于MPM2检测，用在PBS-T中的2.5％BSA（参见Recipes）代替在标准条件下使用的TBS-T中的5％脱脂乳封闭硝酸纤维素膜。用MPM-2抗体（BSA封闭溶液中的1:500稀释液）孵育膜，在4℃下温和搅拌过夜或在室温下温育2小时。在用BSA封闭溶液洗涤3次，每次5分钟后，用HRP缀合的山羊抗兔二抗（在BSA封闭溶液中1:1000稀释）孵育膜，在室温下温和搅拌1小时。
11. 使用ECL检测试剂（根据制造商的方案）和Alliance 4.7软件进行Western印迹图像采集。
  注意：在与对照IgG裂解物特异性结合的情况下，应进行预清除步骤。向每个样品中加入100μl（50％珠/缓冲液）Protein G Sepharose珠，并在4℃下轻轻旋转孵育1小时。旋转珠子和收集上清液。按照步骤C3中所述加入免疫沉淀抗体。

数据分析

通过使用Alliance 4.7软件（UVITECH）对获得的图像进行密度测定分析来确定免疫沉淀的靶蛋白的定量。使用UVIband成像仪软件（Amersham）测定对应于Input（总裂解物的1/20）和免疫沉淀级分的条带的体积。免疫沉淀的量相对于相应的输入标准化。

代表数据

代表性实验的结果如图1所示。

图1.在HEK-293细胞中异位表达或在小鼠脑中内源性存在的PSD-95的MPM-2介导的免疫沉淀。在HEK-293细胞中异位表达的FLAG-PSD-95被免疫沉淀与抗MPM-2抗体。如所示，每个样品运行两次以用抗FLAG和抗MPM2抗体进行免疫印迹。小鼠IgG用作阴性对照。 B.PSD-95从脑提取物中沉淀，并使用抗MPM2抗体在Western印迹中揭示。星号表示由于二抗与免疫沉淀中使用的IgG重链的交叉反应性导致的背景条带注意：只有一部分PSD-95在S-T/P共有基序处磷酸化（比较输入泳道）。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
4.3mM Na 2 HPO 4
1.47mM KH 2 PO 4 sub/
调节至最终pH为7.4
注意：在PBS-T中加入0.1％吐温20。
MPM-2裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 1％NP-40
0.5％Triton X-100 150mM NaCl 10％甘油 10 mM原钒酸钠 1mM的氟化钠 1％磷酸酶抑制剂混合物1
1x cOmplete TM 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物
磷酸酶抑制剂
1mM原钒酸钠 1mM的氟化钠磷酸酶抑制剂鸡尾酒1
IP洗涤缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 100 mM NaCl
0.1％Tween 20
0.1％SDS
10 mM原钒酸钠 1mM的氟化钠 1％磷酸酶抑制剂混合物1
1x cOmplete TM 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物
2x Laemmli样品缓冲液
100 mM Tris-HCl（pH 6.8）
4％SDS
20％甘油 1％2-巯基乙醇 0.001％溴酚蓝
Western印迹运行缓冲液
25 mM Tris
190 mM甘氨酸 0.1％SDS
Western印迹转移缓冲液
25mM Tris（pH8.3） 192 mM甘氨酸 10％甲醇
0.1％SDS
Tris缓冲盐水-Tween 20（1×TBS-T） 50mM Tris（pH7.6） 150mM NaCl 0.1％Tween 20
BSA封闭溶液（也用作抗体孵育缓冲液）
1x TBS-T
2.5％BSA

注意：所有缓冲液都储存在RT，除了BSA封闭溶液保持在4℃（不超过一周）。样品缓冲液不用2-巯基乙醇储存，在使用前新加入。只有免疫沉淀过程所需的缓冲液体积在冰上预冷却，并在即将使用前提供蛋白酶和磷酸酶抑制剂。将所有抑制剂重悬浮于灭菌的MilliQ水中，等分并保存在-20℃。原钒酸钠制备为在无菌MilliQ水中的200mM储备溶液，将pH调节至10.0。在该pH下，溶液是黄色的。为了确保钒酸盐单体的存在，将溶液煮沸直至半透明，并将pH再调节至10.0。

致谢

我们感谢S. Vicini博士（乔治城大学医学院，华盛顿特区，美国），提供PSD-95 cDNA。这项工作得到了Beneficentia基金会（BEN 2014/08）和Telethon（GGP11043）的资助。

参考文献

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