材料和试剂

消耗品
1. 商业卷烟纸
2. 聚四氟乙烯（PTFE）膜（由Hansatech，King's Lynn，England提供）
3. 15ml管（STARSTEDT，目录号：62.554.016）
4. 1.5ml管（Sigma-Aldrich，目录号：Z606340）
5. 毛巾
6. Greiner Petri dish（60×15mm）（Greiner Bio One，目录号：628161）
7. 维护套件（Hansatech，King's Lynn，England）
C。 elegans 菌株（野生型[N2]和 dct-1 [tm376] ）
大肠杆菌 OP50菌株（获自Caenorhabditis Genetics Center）

化学试剂

蒸馏水
罐中提供的氮气
PierceBCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：23225）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：1048731000）
K _{2 HPO ₄}
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：1064041000）
Bacto ^TM蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211677）
链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S-6501）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05040）
胆固醇储备溶液（SERVA电泳，目录号：17101.01）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C-5080）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M-7506）
制霉菌素储备液（Sigma-Aldrich，目录号：N-3503）
（EMD Millipore，目录号：1065860500）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P-5405）
氯化钾（KCl）缓冲液（见配方）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（见Recipes）
M9缓冲液（无菌;参见配方）
磷酸盐缓冲液（无菌;参见配方）

设备

解剖立体显微镜（Olympus，型号：SMZ645）
稳定温度的培养箱（AQUA LYTIC培养箱20°C）
DW1/AD clark型极谱氧传感器（Hansatech Instruments，型号：Oxygraph Plus System）
20℃水浴
台式离心机（Eppendorf，型号：5424）
超声波仪（Sonics& Material，型号：VC 130PB）

软件

Oxygraph Plus软件（Hansatech，King's Lynn，England）
Microsoft Office 2011 Excel

程序

线虫群体的生长和同步
1. 使用解剖立体显微镜选择每个菌株的L4幼虫。将4-6LL幼虫放在新鲜大肠杆菌（OP50）接种的NGM板上（图1A-1C）。每种线虫菌株至少使用三块板。
  
  图1.实验室中的Caenorhabditis elegans 。 A. 大肠杆菌（OP50）在解剖立体显微镜的基部上接种NGM平板。细菌草坪在琼脂的表面上可见。 B.通过解剖立体显微镜观察的线虫的混合群体。线虫在板表面上留下轨迹，指示它们在细菌草坪上的移动。比例尺= 1mm。 C.在发育期间，蠕虫在四个幼虫阶段（L1，L2，L3和L4）中的尺寸增加。 L4雌雄同体线虫可以通过发育的外阴（红色箭头）区分，其是在腹侧中心的清楚的半圆。比例尺= 0.5mm。
2. 在20°C的标准温度下孵育蠕虫。
3. 四天后，盘子含有混合的线虫群（图1B）
4. 通过在解剖立体显微镜下挑取每个菌株的L4幼虫来同步线虫，并将它们转移到单独的平板上。
5. 每板添加20-25LL幼虫。对于每个实验条件，至少使用五块板
设置电极盘和电极室
1. 阅读手册，根据制造商的说明正确组装电极室
2. 切割1.5cm的纸隔片（卷烟纸）和类似尺寸的聚四氟乙烯（PTFE）膜（图2A;视频1）。
  
  图2. C中的氧消耗率。。A.氧测量仪器的备件：1.氧测量电极控制单元2.氧测量室（顶板，水套，硼硅酸盐玻璃反应容器和基环，3.聚四氟乙烯膜，4.商业香烟纸，5.膜施加器，6.电极盘，7.小和大O型环，8.标准柱塞组件，9.Oxygraph Plus软件，10.电极维护套件（棉花芽和快速Hansatech抛光糊）B.斜率描绘了野生型（2,4,6）和dct-1（tm376）（1,3,5）动物测量时的氧消耗速率C.氧消耗对于总蛋白含量标准化的速率，DCT-1耗尽的动物显示出增加的氧消耗水平（***
  <0.001>未配对的测试）。
  
  <！ - flashid2049v134开始 - >
  strong>视频1.在耗氧量测量期间制备电极盘和腔室
  
  ！ - flashid2049v134结束 - >
3. 将一小滴氯化钾（KCl）缓冲液放在电极圆盘的顶部（视频1）。
4. 将卷烟纸放在圆顶的中心，并用类似尺寸的PTFE膜覆盖（图2A;视频1）。
5. 将小O形圈放在圆顶上，然后放置大O形圈（图2A;视频1）。如果没有放置大O型圈，则当盘安装在电极室中时，由于密封受损，测量将受环境空气的影响（见注1;视频1）。
6. 一旦电极盘已经成功准备好，在任何实验之前检查盘的响应。将电极盘连接到控制单元。
7. 打开软件并开始录制。几分钟后，信号将稳定，并在空气中为约2,000mV。
8. 通过呼吸电极测试电极盘。由于氧水平降低，应该观察到信号的急剧下降。然后，当环境氧气在电极盘周围平衡时，信号应该返回到原始水平
9. 如果信号没有响应，则可能是由不适当的电极准备引起的。然后，拆开电极盘，清洁电极，并重复上述步骤（步骤B1-B8）。
电极盘的液相校准
1. 将准备的电极盘安装到电极室（图2A，视频1）。
2. 将电极室放置并连接到控制单元的后部（图2A）。
3. 将2毫升无菌蒸馏水放入反应器的反应容器中
4. 在校准过程之前，应将水平衡至测定温度。将水浴设置在所需温度，并将其与电极室连接，以在实验过程中保持稳定的温度（见注2）。
5. 打开Oxygraph Plus软件，设置适当的温度和大气压力
6. 打开搅拌器以平稳地搅拌样品，避免产生气泡，这可能会导致噪音信号
7. 等待直到达到信号的平稳。
8. 建立零氧条件。将氮气鼓入腔室的反应容器中以除去样品中的所有氧气。等待信号达到平稳状态。
9. 向室的反应容器中加入1ml M9缓冲液，等待系统平衡
评估样品的氧气消耗率
1. 在整个实验过程中启用搅拌。
2. 使用M9缓冲液冲洗NGM板，并在15ml管中收集线虫
3. 让动物在重力下沉降几分钟。使用成虫。去除大部分含有细菌，卵和幼虫的上清液（L1，L2，L3和L4）。重复此步骤两次。最后一次洗涤后，将体积减少至〜1.5 ml
4. 从反应容器中取出M9缓冲液（见注3）
5. 向室的反应容器中加入1ml线虫悬浮液
6. 监测氧消耗5-10分钟。
7. 准备下一个样品。洗去含有不同菌株或处理动物的其他平板。重复步骤D3-D5。
8. 从反应容器中彻底回收动物，并将它们放在1.5ml管中（见注3）。
9. 将管放在冰上。管子应保存在冰上，直到蛋白质测定
10. 测量下一个样品。重复步骤D5-D9（见注4）。
11. 保存从Oxygraph Plus软件记录的数据（图2B）。
12. 从冰中收集样品，进行蠕虫裂解和蛋白质测定
13. 将超声仪尖端插入样品，并使用十（10）脉冲，每次70％的功率对每个样品进行声波处理。立即将样品放在冰上（见注5）
14. 在4℃下将样品在14,800×g下旋转10分钟。
15. 将上清液（溶解的蛋白质）转移到新的1.5ml试管中，并使用标准蛋白试剂盒（如PierceBCA蛋白测定试剂盒）按照制造商的说明书测定蛋白质浓度（估计的蛋白质浓度范围：0.05 -0.9μg）。
16. 打开并查看Microsoft Office 2011 Excel（图2B）中的数据（在步骤D11中获得）。
17. 在Microsoft Office 2011 Excel软件中将负斜率（步骤D6中获得的氧消耗）与总蛋白量（nmol/min/ml/mg）的比率相除（图2C）。
18. 将数据进行进一步和更高级的统计分析（图2C）
电极维护和存储
1. 使用后清洁电极盘。
2. 使用小棉球和维护套件中的抛光膏。
3. 轻轻取出，去除通常在银电极上产生的氯化银和氧化盐（KCl）的棕色/黑色沉积（见注6）。重复抛光，直到电极表面上的所有棕色/黑色沉积物被清除
4. 轻轻抛光电极圆顶的中心，避免刮伤。
5. 用蒸馏水冲洗电极盘，清除抛光膏的所有痕迹（见注7）。
6. 使用纸巾擦干电极盘。
7. 将电极盘存放在密封容器中。

数据分析

对于每个菌株或条件，使用至少100只动物，以获得更准确的结果。
对于每个实验，应当对每种菌株和条件检查相同数目的线虫。
每个测定应重复至少三（3）次。
使用学生的 t 测试，其显着性截止水平为 P 0.05用于两组之间的比较。
使用单因素（ANOVA）方差分析，并通过事后Bonferroni检验进行多重比较。

笔记

不要拧得太紧，因为它可能会导致测量过程中的漂移信号过大拧紧大O型圈。
氧气电极盘对影响氧气水平的温度波动非常敏感。在整个实验期间保持实验温度稳定。在进行任何校准和/或测量之前，将电极盘平衡至测定温度
小心不要在缓冲液移除期间破坏电极盘的膜。
对每个应变或条件进行三次独立测量。
在超声处理期间，样品应保持冷以避免蛋白质降解。在超声处理期间不断地在冰上孵育样品
电极盘不应该在KCl就位的情况下干燥。 KCl残余物的结晶会氧化并破坏电极。将光盘维持在高标准是非常重要的
在维护过程中不要润湿光盘的电连接器。

食谱

磷酸盐缓冲液（1M）

对于1L，在蒸馏水中溶解102.2g KH 2 PO 4和57.06g K 2 HPO 4，并且填充高达1 L.这是1M溶液，pH 6.0
高压灭菌并在室温下贮存

线虫生长培养基（NGM）琼脂平板

混合3g NaCl，2.5g Bacto TM蛋白胨，0.2g链霉素，17g琼脂并加入900ml蒸馏水。高压灭菌器
让温度降至55-60°C
加入1ml胆固醇储备溶液，1ml 1M CaCl 2，1ml 1M MgSO 4（无菌），1ml制霉菌素储备溶液，25ml无菌1M磷酸盐缓冲液，pH 6.0，和蒸馏无菌水至1L
每培养皿倒约8ml培养基，并固化
保持板在4°C，直到使用

M9缓冲区

在1L蒸馏水中溶解3g KH 2 PO 4，6g Na 2 HPO 4，5g NaCl水。高压灭菌器
冷却并加入1ml 1M MgSO 4（无菌）
将M9缓冲液储存在4°C

氯化钾（KCl）缓冲液

将17.5g KCl溶于100ml蒸馏水中
将KCl缓冲液储存在4°C

致谢

这项工作由欧洲研究委员会（ERC），欧洲委员会7 框架计划和博多萨基金会博士后研究奖学金资助。该协议已经改编自Palikaras等人。（2015）Nature 521,525-528。

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