材料和试剂

尺寸000明胶胶囊（ProSciTech，目录号：RL039）
剃刀刀片
显微镜幻灯片（Livingstone，目录号：7107-PPN）
22 x 50 mm，0.17 mm厚的盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-543C）
番茄花2天施肥（DBF）和2天后施肥（DAF）从温室栽培的cv。 Moneymaker番茄植物
50mM PIPES（Sigma-Aldrich，目录号：F6757）
AR级EtOH（Sigma-Aldrich，目录号：32205）
注意：本产品已停产。
ddH ₂ O
LR白色树脂（ProSciTech，目录号：C023）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G9391）
细胞壁转化酶（LIN5）纯化的多克隆抗体 - 兔产生（Mimmitopes - 定制）
转化酶（INH）纯化的多克隆抗体 - 兔产生的抑制剂（Mimmitopes - 定制）
TBST（Sigma-Aldrich，目录号：T9039）
次级抗兔IgG荧光素异硫氰酸酯（FITC）（Sigma-Aldrich，目录号：F9887）
山羊中产生的抗兔IgG（全分子）-FITC抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F6005）
注意：本产品已停产。
苯胺蓝（在ddH 2 O中为0.1％）（Sigma-Aldrich，目录号：B8563）
（Mowiol）（Sigma-Aldrich，目录号：10852）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:500）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
Calcofluor白色（在ddH 2 O中为0.1％）（Sigma-Aldrich，目录号：F3543）
2％多聚甲醛
戊二醛
CaCl 2
Tris
NaN <3>
牛血清白蛋白（BSA）
固定解决方案（请参阅配方）
阻塞缓冲区（见配方）

设备

旋转器
解剖显微镜或放大镜
Reichert Ultracut E切片机（Reichert，型号：701704）
DiATOME Histo刀，钻石，45°，4.0-4.9mm（ProSciTech，目录号：UH45-40）
通风柜
烧杯
Axio Scope.A1 epiflourescence复合显微镜（ZEISS，型号：Axio Scope.A1）
发射FITC滤光片（50-490nm激发，长波长515nm）
发射UV滤光片（365nm激发，短波420nm）
AxioCam数码相机（ZEISS ^TM）或等效的

软件

AxioVision V4.8软件
Adobe Bridge CS4软件
Abode Photoshop CS4软体

程序

样品制备
1. 从番茄植物番茄植物中收获全番番茄2朵DBF和2朵DAF，并在真空（300毫米汞柱）下，在冰上固定溶液4小时，以除去气泡并淹没整个花朵。
2. 在50mM PIPES中洗涤3×10分钟，并在4℃下储存过夜。
3. 在乙醇脱水之前，在ddH 2 O 2中再进一步3×10分钟。
4. 乙醇脱水系列以10％的增量进行10-100％，而花被浸泡在5ml溶液中，每4℃加入1小时，最高达70％，然后将组织储存过夜。
5. 第二天剩余的增量为80％，90％在室温下施用1小时。一旦在100％乙醇中，花以100％的速率洗涤两次，每1小时增量一次，然后再次存放过夜
6. 用乙醇稀释LR白色树脂，并在室温下在旋转器上进行如上进行的LR白色浓度的10％至100％的渗透系列。
7. 一旦样品在100％LR白色树脂中，每2-3天更换5ml新鲜的100％LR白色溶液，持续三周。
8. 尺寸为000的明胶胶囊填充有LR白色树脂，并在60℃（〜12小时）下部分聚合。然后将花瓣放置在每个胶囊的中间，花瓣朝上，部分聚合的树脂上充满LR白色树脂。
9. 将明胶胶囊密封并置于60℃烘箱中48小时，直到树脂完全聚合。
10. 然后用解剖显微镜在每个花样品周围用剃刀刮刀硬化胶囊，在所有表面上留下1mm树脂。
11. 修剪的块被牢固地固定在Reichert Ultracut E切片机上，并且使用45钻石DiATOME Histo刀（4.0-4.9mm）切割1μm厚的切片。
12. 切片在刀片舟皿内在RT上漂浮在水上，然后在明胶包被的LIVINGSTONE TM超声显微镜载玻片上转移到一滴ddH 2 O。
13. 将三个部分放置在每个载玻片上，并在实验室升温托盘上在45℃的通风橱中在烧杯下干燥，氯仿浸泡的棉絮芽附着在下面，直到水分蒸发，并且该部分平坦化到载玻片上。 br />
免疫标记
1. 将1ml阻塞缓冲液吸移到载玻片上2小时（可以使用疏水笔来防止泄漏）。过量溶液从每个载玻片的边缘干燥。
2. 此后，将200μl在TBST中稀释的LIN5或INH抗体移液至每个载玻片并在室温下孵育1小时。
3. 然后用TBST洗涤3×20分钟的幻灯片。再次用无绒纸（无接触切片）从载玻片中吸收过量溶液，并在TBST中以1:200的稀释度施用在山羊中产生的第二抗兔IgG荧光素异硫氰酸荧光素（FITC）缀合的抗体，孵育1小时， RT在黑暗条件下如上。
4. 在TBST中随后洗涤步骤，然后用ddH 2 O（图1A）洗涤如上所述的幻灯片。
复印
1. 开发了一种新的复染方法，以确定LIN5和INH的细胞定位。
2. 免疫标记后，将200μl苯胺蓝施用于洗涤的部分，并在黑暗条件下孵育20分钟。
3. 在保持45°的情况下，通过缓慢移液5 ml TBST，然后将切片安装在20μl马可酯 - 苯二胺（马可酚）中，然后涂上22 x 50 mm长的盖玻片，洗掉过量的苯胺蓝。
4. 部分由ZEISS ^TM AxioScope查看。 A1 epiflourescence复合显微镜。使用450-490nm的激发，长通515nm发射FITC滤光片，以100x物镜在油浸液下观察免疫标记（图1A）。
5. 一旦检测到免疫标记信号，就可快速切换到365nm激发，通过420nm发射紫外滤光器组，以便在结合苯胺蓝时检测荧光胼filter质，随后者快速消失。使用AxioVision V4.8软件在ZEISS ^TM AxioCam数码相机上捕获图像（图1B）。过滤器组返回到FITC，并在同一目标区域拍摄另一张免疫标记图像（图1A）。
6. 当从显微镜平台上移除每张幻灯片时，必须注意将台架保持在相同位置，并注意幻灯片的方向。
7. 一旦幻灯片被移除，盖玻片就会非常小心地从幻灯片上滑下来并被丢弃。
8. 切片用如上所述的TBST洗涤，除去除去所有过量的马索醇，并加入200μl1：500 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）以定位核仁，并在室温下孵育30秒。
9. 用TBST去除过量的DAPI，如上所述重新安装滑块。
10. 在FITC滤波器之前，重新获取和对准目标区域，并将其与先前捕获的图像进行比较（图1A），然后切换到长通道420nm发射UV滤光片组并捕获DAPI染色细胞的图像（图1C ）。
11. 与DAPI复染方法一样，Calcofluor白色染色如上所述进行标记细胞壁纤维素（图1D）。
12. 然后使用Abode Photoshop CS4软件包导出所有图像并重叠（图1E）。
  
  图1.胎盘血管区2 DBF的嵌入番茄花的树脂。A.在筛孔的细胞壁上免疫标记LIN5抗血清; B.将具有苯胺蓝色的相同部分的复染显示在筛子元素的前端和后端的筛板; C.用DAPI进一步复染同一部分，显示周围细胞的核，并且筛孔内没有细胞核; D.用calcofluor白色染色的细胞壁的虚假红色图像; E.叠加A，B，C和D. [缩放]覆盖，显示在筛元件的细胞壁内的LIN5定位。在ZEISS复合荧光显微镜上获得的所有图像均为100倍物镜。刻度棒=10μm。标记细胞类型=（N）核，（CC）伴侣细胞，（PP）韧皮实质，（SP）筛板和（SE）筛分元素。（此图像由Palmer等人，2015年出版）

数据分析

图像序列被导入到Adobe Bridge CS4软件中，然后被加载到Adobe Photoshop CS4软件中，并且覆盖了不透明度和强度水平的调整。

笔记

明胶涂层的载玻片需要良好的涂层，以确保在清除盖玻片时切片在显微镜载玻片上的稳定性，以获得获得的图像的最佳覆盖。

食谱

固定解决方案
50 mM PIPES，pH 6.8
2％多聚甲醛
1.5％戊二醛
2mM CaCl 2
阻塞缓冲区
20mM Tris，pH 7
150 mM NaCl
0.2％NaN 3
2％牛血清白蛋白

致谢

该方法的精简版本最初发布于Palmer等人，2015年。
这项工作得到了中国国家科学基金会的统一支持（授权号码 30425043 和澳大利亚研究委员会（ ARC DP110104931 到YLR和 DP120104148 到YLR和JWP）。

参考文献

Palmer，WM，Ru，L.，Jin，Y.，Patrick，JW and Ruan，YL（2015）。