材料和试剂

1.6孔板（Corning，Costar ，目录号：3516）
玻璃盖玻片（13mm，＃1.5）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：1014355130NR15）
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：6776214），将所述玻璃载玻片置于玻璃载玻片上。
Caco-2人结肠腺癌细胞（ATCC，目录号：ATCCH TB-37 ^TM）。
质粒：GFP-NMIIA（Addgene，目录号：11347）
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11875093）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：26140079）
100x青霉素/链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140122）
100x L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030081）
Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：L3000015）
Opti-MEM ，血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985070）
Alexa Fluor 647鬼笔环肽（Thermo Fisher Scientific，Moecular Probes ^TM，目录号：A22287）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
抗体

抗肌球蛋白IIA兔多克隆抗体（Biolegend，目录号：PRB-440P）
注意：该抗体靶向NMIIA重链的C末端部分。
山羊抗兔IgG（H + L）第二抗体，Alexa Fluor？546缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A11035）

TetraSpeck TM多多斑点100nm珠（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：T7279）
ProLong Gold防褪色封固剂（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：P36934）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）（PIPES）（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
乙二醇 - 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
Tris-Cl（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
没有Ca 2+和Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：14190250） br />
10x胰蛋白酶/EDTA（0.5％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15400054）
4％多聚甲醛（PFA）（参见配方）
Tris缓冲盐水（TBS）（参见Recipes）
阻止缓冲区（参见配方）

设备

细胞培养瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：156472）的微量滴定板
孵化器
Zeiss ELYRA超分辨率显微镜（ZEISS，型号：ELYRA超分辨率显微镜）

软件

禅（黑版;蔡司）
FIJI（ http://imagej.net/Fiji ）
Prism，GraphPad（ http://www.graphpad.com/scientific - 软件/棱镜/）
Matlab，Mathworks（ https://www.mathworks.com/index- c.html ）
用于minifilament分析的FIJI和Matlab脚本（请参阅附录I 和 II

程序

制备和转染Caco-2细胞
注意：这种技术用于我们最近的Developmental Cell文章（Michael等人，2016）。

在补充有10％FBS，青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺并在37℃，5％CO 2中维持的RPMI培养基中培养Caco-2细胞。

对于转染，在含有4x盖玻片的6孔板中以200,000细胞/孔平板细胞均匀分散并平放在每个孔内。

一旦细胞达到〜50-80％汇合（铺板后约36-48小时，图1），使用Lipofectamine 3000试剂根据制造商的说明用GFP-NMIIA质粒转染细胞。

图1.使用20x物镜48小时电镀后Caco-2细胞的DIC图像。图像显示600 x 600μm的视野。

对于转染，将2μgDNA在含有5μlP3000试剂的190μlOpti-MEM中稀释。在单独的试管中，将5μlLipofectamine 3000在190μlOpti-MEM中稀释。然后将两种混合物合并，并在室温下温育10分钟，并施加到每孔含有1ml Opti-MEM的细胞中。

将细胞返回37℃培养箱，6小时后，用生长培养基替换转染培养基。离开细胞在孵化器内生长另外24小时，然后固定。使用荧光显微镜在24小时转染后可以在30-40％的细胞中观察到GFP标记的质粒的表达（图2）。

图2.用epifluorescence显微镜取得的24小时转染后Caco-2细胞的低放大倍数图像。将细胞固定并使用Alexa Fluor 647鬼笔环肽染色。
免疫荧光

固定细胞在冰上用4％PFA 20分钟，然后在冰上用0.25％Triton X-100在TBS中透化5分钟。

在室温下用封闭缓冲液（参见Recipes）封闭细胞1小时，随后与抗肌球蛋白IIA抗体（1:1000稀释）在室温下温育1小时。使用的所有抗体在封闭缓冲液中稀释

用TBS洗涤3次。然后，用山羊抗兔Alexa Fluor 546二抗（1:500稀释）和鬼笔环肽Alexa Fluor 647（1:500稀释）孵育细胞1小时）。

用TBS再次洗涤细胞3次，然后通过将盖玻片倒置到含有5μlProLong Gold安装试剂滴的载玻片上来安装盖玻片。
肌球蛋白IIA和F-肌动蛋白在子宫粘膜上的成像

在Zeiss Elyra超分辨率显微镜上使用60倍物镜，1.4 NA Plan Apochromat油浸镜头对免疫染色的盖玻片进行结构化照明显微镜（SIM）。

使用488,561,640nm激光器进行3通道成像以检测GFP-NMIIA荧光，NMIIA C-末端抗体（Alexa Fluor 546）和鬼笔环肽（Alexa Fluor 647）在zonula adherens（ZA）。

通过通道特定的光栅在网格图案的5个相位和3 120°旋转获取单个z切片的图像。

使用噪声过滤级别为-4.5和光学截面值为100的Zen软件执行图像重建。

使用先前通过测量4色珠粒对齐样品（多斑点珠粒）获得的预校准值对重建的图像进行通道对齐。

最终的图像显示NMII的假性肌节组织在ZA装饰鬼笔环肽标记的F-肌动蛋白丝（图3A）。此外，由于SIM技术和N末端标记的GFP-NMIIA和C末端NMIIA抗体标记组合的增加的分辨率，NMIIA双极细丝可以被详细地可视化为一组绿色 - 红色 - 绿色斑点（图3A和3B）。

图3.最终SIM图像的放大区域 A.表达GFP-NMIIA（绿色）和NMII（红色）C末端免疫染色的细胞 - 细胞连接的SIM图像。鬼笔环肽标记（蓝色）用作连接F-肌动蛋白的标记。 B. NMII双极细丝组织及其通过SIM的可视化的图示。比例尺= 1μm。

数据分析

在ZA的NMIIA微丝取向的定量

概述

步骤1（FIJI软件）：使用SIM数据的RGB图像绘制（图4）感兴趣区域（ROI），其对应于：

根据鬼笔环肽（蓝色）染色的细胞 - 细胞连接作为指导，使用FIJI中的分段线工具。

每个单独的肌动球蛋白微丝（绿 - 红 - 绿点），使用FIJI中的直线工具。

图4.三色SIM图片的裁剪区域，显示用于分析的ROI详细信息。左图，具有ROI的RGB图像。右，ROI的示意图。需要绘制的第一个ROI是对应于细胞 - 细胞连接（蓝色），然后是对应于单个小丝的不同ROI的那个。

步骤2（FIJI软件）：使用此协议中提供的FIJI脚本将感兴趣区域保存为XY坐标（附录I ），以.txt格式（图5）。

图5. XY平面中不同ROI的图形表示。使用FIJI脚本导出为.txt文件的ROI（附录I）被导入到MATLAB中并显示为一个图形（该图是自动生成的运行MATLAB脚本，附录II ）。

步骤3（MATLAB软件）：测量结点（θ）的切线和小丝（γ）的取向之间的角度。角度=θ-γ（图6）。

图6.基于不同ROI的空间信息计算小纤维的相对取向的示意图。红色箭头表示微丝，γ表示定义其向量的局部取向的角度。蓝色箭头表示接合处的局部角度，由θ表示，由与相应小丝的接合点的最近点定义。

步骤4（MATLAB软件）：测量小丝到接合处的距离（图7）。

图7.小细丝和细胞 - 细胞连接之间的距离的计算的图形表示

步骤5（MATLAB软件）：测量对应于不同小丝的ROI（"小丝长度"）的长度（图8）。

图8.具有不同ROI的位置的SIM图像的放大视图

步骤6（PRISM或Excel软件）：结果的准备
这里，从该分析获得的量是：（1）角度值的标准偏差，其是平行于接合处的小丝的相对组织的指数; （2）小丝对结合部的平均距离，小纤维与细胞 - 细胞接合部紧密相关的指数，以及（3）小纤维的平均长度，其反映肌球蛋白的能力（和机械张力）肌动球蛋白进入肌节结构

实践程序

使用针对FIJI和MATLAB的定制脚本进行小丝比对的定量（参见附录一和附录二）。

在FIJI中打开3通道图像。在连接处的F-肌动蛋白被可视化为一束线性F-肌动蛋白丝（图3）。使用鬼笔环肽通道作为参考，在F-肌动蛋白束（对应于结）的中间绘制手绘线，并且将该线添加到ROI管理器（参见图4，也是步骤A1a.i）。

使用合并的3通道（RGB）图像，使用线工具（步骤A1a.ii）标记每个小丝（由绿 - 红 - 绿斑点定义）并添加到ROI管理器（参见图4）。 ROI管理器与RGB图像一起保存在文件夹中。

使用'FIJI脚本进行minifilament分析'，为FIJI定制的宏（ Appendix I ），从ROI中提取连接F-肌动蛋白和小丝的坐标，并将这些坐标保存为.txt，稍后在MATLAB中使用以确定小丝角度，长度和距离。通过选择插件 - >新建 - >宏可以轻松创建宏。将出现一个窗口，其中的脚本位于附录I 可以粘贴。然后，从该窗口可以运行宏。

打开MATLAB并选择包含RGB SIM图像的目录（其中存储具有ROI的XY坐标的.txt文件）。

打开MATLAB并通过复制和粘贴'MATLAB脚本进行minifilament分析'创建一个新脚本

修改代码的第一行以包括要分析的正确ROI数。

运行脚本（MacOS中的"command + alt + R"）。

运行脚本后出现3个数字（图9）。
这些数字可以保存为EPS，JPEG或TIFF格式在MATLAB中。我们建议将这些格式保存为EPS格式，因为这些格式是完全可编辑的，并且适合Adobe Illustrator中的后续图形准备。

图9.使用附录II中的脚本从MATLAB中得到的结果。 A.对应于放在同一坐标原点上的不同小光盘。从这里可以了解小丝相对于细胞 - 细胞连接的取向分布。 B.对应于图4所示的微丝取向的极坐标直方图。C.显示不同微丝沿着连接位置的矢量图。

数值结果

在MATLAB的工作区中，变量"AAResults"将包含用于统计分析的数值结果（图10）。
此变量有5列：
第一列：细丝长度
第二列：小丝距离连接点的距离
第三列：小丝相对于连接点的相对取向（角度）
第4列：微丝矢量的X分量
第5列：微丝矢量的Y分量

图10. MATLAB中"AAResults"表的屏幕快照。此表包含不同分析的数值结果。

复制列1到3并粘贴到PRISM或Excel软件中，以执行以下参数的统计分析：
平均细丝长度（第1列的平均值）。
平均小丝和细胞 - 细胞接合处之间的距离值（第2列的平均值）。
微丝与细胞 - 细胞连接处的角度的标准偏差（第3列的标准偏差）

然后可以在不同的实验条件之间比较这些值，如在（Michael等人。，2016）中。

注意：

如果要分析的连接点太垂直，请修改Matlab代码的第二行以使其
Rotate45 = 1.
这将防止代码在运行时过早停止。
分析AA结果的第4列的负值的存在。代码和分析设计为以此列中的值应为正数的方式运行。如果此列存在某些负值，则应从分析中排除包含它们的行。

食谱

4％多聚甲醛（PFA，在细胞骨架稳定缓冲液中）将PFA溶解在pH 6.8的10mM PIPES中
100 mM KCl
300mM蔗糖 2 mM EGTA
2mM MgCl 2/
将pH调节至7.0
在-20℃下以10ml等分试样存储
Tris缓冲盐水（TBS）
50mM Tris-Cl 150mM NaCl 溶解在Milli-Q水中
将pH调节至7.5
阻塞缓冲区
将5％（wt/vol）BSA溶解于1×TBS中

致谢

该协议是在（Michael等人。，2016）中发布的协议的改编版本。这项工作得到澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（1037320,1067405），澳大利亚研究委员会（DP120104667,150101367）和儿童癌症项目的肿瘤学儿童基金会的资助。光学成像在由澳大利亚癌症研究基金会的慷ous支持建立的ACRF/IMB癌症生物学成像设施和由ARC LIEF授权（LE130100078）支持的昆士兰大学研究所显微镜设备建立。

参考文献

在这种情况下，我们可以使用一个简单的例子来描述这个例子，这个例子中，我们可以看到，/inf> 24（10）：1160-368（2004）。在这些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗和预防非肌肉肌球蛋白II同种型的方法，
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